单细胞测序为什么这么火热
答：「单细胞测序发表的文章档次都很高。」
未来会不会成为一个研究热点？
答：「已经是热点了，小编相信在今后的一段时间，单细胞测序在国自然项目申请中将是一个有竞争力的前期基础」。
真的会是这样吗？
今天就和大家来介绍一篇 2023 年 4 月 17 日发表在Cell上的关于单细胞测序的研究，这篇「Pyramidal neurons form active, transient, multilayered circuits perturbed by autism-associated mutations at the inception of neocortex」是由 Botond Roska 教授及其团队发表的。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.025
研究概要
皮层回路主要由锥体到锥体的神经元连接组成，但它们在胚胎发育过程中的组装尚不清楚。这篇文献作者在转录组学上最接近第 5 层锥体神经元的小鼠胚胎 Rbp4-Cre 皮层神经元在体内表现出两个阶段的电路组装。在 E14.5，它们形成一个多层电路基序，仅由胚胎近投射型神经元组成。到 E17.5，这转变为涉及所有三种胚胎类型的第二个基序，类似于三种成年第 5 层类型。胚胎 Rbp4-Cre 神经元的体内膜片钳记录和双光子钙成像显示，从 E14.5 开始，活跃的胞体和轴突、河豚毒素敏感的电压门控电导和功能性谷氨酸能突触。胚胎 Rbp4-Cre 神经元强烈表达自闭症相关基因，干扰这些基因会干扰两个基序之间的转换。因此，锥体神经元在新皮层开始时形成活跃、短暂、多层的锥体到锥体回路，研究这些回路可以深入了解自闭症的病因。
研究成果
作者通过单细胞测序对小鼠发育中的皮层细胞进行评估，并通过 tdTomato expression 再聚类 Rbp4-Cre 神经元（图 1A）。为了比较 Rbp4-Cre 神经元与成年皮层神经元的同一性，作者使用了一组 26 个具有层特异性表达的标记基因。在所有实验的胚胎期，Rbp4-Cre 神经元表达与成年皮层 L5 PNs 相关的标志基因。特别是，从 E13.5 开始，Rbp4-Cre 神经元表达 Bcl11b，这一标志基因只在 L5-PNs 成年皮层中表达（图 1B-C）。这些实验表明，在胚胎发育过程中，Rbp4-Cre 神经元在转录组学上最接近成年 L5 PNs。成年 L5 PNs 分为 IT、PT 和 NP 神经元类型。为了研究 Rbp4-Cre 神经元是否也分为细胞类型，作者对单个 Rbp4-Cre 神经元的转录组进行了聚类分析，发现了三个不同的聚类（图 1D）。结果（图 1D-F）表明，Rbp4-Cre 神经元可分为三种细胞类型，并且这种细胞类型的组成受到发育调控。
图 1. 单细胞测序证实小鼠胚胎 Rbp4-Cre 神经元具有 L5-PN 标记
为了揭示三种 Rbp4-Cre 细胞类型如何分为三层，作者对每种 Rbp4-Cre 细胞中优先表达的基因进行了原位杂交。发现胚胎 NP-Rbp4-Cre 神经元的形态在新皮层发育过程中会发生变化，这种形态和位置的变化可能是由于胚胎 NP 神经元的不同亚型的存在，或者由于胚胎 NP 类型内形态的变化。注射溴脱氧尿苷（BrdU）后，发现有部分神经元重叠（图 2D），但在统计学上无法区分（图 2E）。随后通过在胚胎胚胎 NP 神经元的基因表达谱，使用相关性作为相似性的衡量标准（图 2F）。发现胚胎 NP 神经元在三个时间点上的相关性与在胚胎 PT 和 IT 类型中观察到的相关性相似。这些观察结果与不同胚胎期的单个胚胎 NP 型 Rbp4-Cre 神经元一致，尽管它们的形态和位置发生了变化。
图 2.Rbp4-Cre 神经元分为浅层、中层、深层三层
作者发现皮层 PNs 的活动在胚胎发育过程中可以表现出复杂的模式。不同皮层内 PN 类型的组成在胚胎发育过程中受到严格调控。尽管同一层中的 PNs 类型已被证明在成人中具有不同的功能作用，但它们在胚胎发育过程中的建立尚不清楚。总之，作者发现揭示了早期发育过程中锥体回路的转换：Rbp4-Cre 神经元在活动、空间组织和细胞类型认同方面表现出转换，所有这些都是在时间上协调的（图 3）。
图 3. Rbp4-Cre 神经元表现出双相 PN 活动模式
之后作者发现这些基因操作干扰了胚胎发育过程中双相 PN 活动模式的过渡阶段。相对于野生型条件下的活性，E16.5 突变 Rbp4-Cre 神经元的活性增加。
其次，作者发现遗传操作导致了多层瞬态电路的扰动。浅层 Rbp4-Cre 神经元在胚胎发育过程中一直持续到出生前一天的 E18.5。此外，随着胚胎的发育，越来越多的浅层神经元在表面聚集在一起。这些集群与每个集群正下方发育中的新皮层的紊乱有关，因此 Rbp4-Cre 神经元向表面移位。有趣的是，这种紊乱还涉及不表达 Cre 的神经元，这表明表达 Cre 亚群的神经元与其他 L5 PNs 之间存在通信。此外，作者报道的小鼠皮层的斑片状组织紊乱让人想起在自闭症儿童中观察到的皮层组织的斑片状结构紊乱。作者鉴定胚胎 PN-PN 活性回路基序的工作，以及作者开发的体内成像和记录方法，为研究与神经发育障碍，特别是自闭症谱系障碍相关的基因对活胚胎中已鉴定回路的影响提供了机会。
图 4. 选择性干扰 Rbp4-Cre 神经元中自闭症相关基因会破坏胚胎期的电路组织和活动及发展
研究总结
这篇研究中作者利用小鼠遗传学并通过单细胞转录组学证实，发现 Rbp4-Cre 小鼠中表达 Cre 的皮层神经元在转录上最接近 L5 PNs。进而通过研究野生型和自闭症相关基因突变小鼠在新皮层胚胎发育过程中神经元群体的空间分布和体内活动，探讨了两个关键问题。首先是第一有源 PN 电路何时形成以及如何发展的问题；其次则是关于自闭症相关基因的突变如何影响胚胎 PN 回路的形成的问题。
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