质粒，小小的身体，大大的能量，对奋战在生物实验室的科研人而言是熟悉的伙伴。科学的车轮缓缓驶过，生化实验室不能失去质粒，正如西方不能失去耶路撒冷。
面对质粒，不少科研人心中五味杂陈，几家欢喜几家愁，质粒构建表达成功皆大欢喜，构建失败轻则耽误时间，重则影响毕业大计。
而有人则因构建质粒水平过于高超，读博多年归来，依然是替全课题组构建质粒的「工具人」，导师抓住一只羊使劲地薅羊毛，誓要让其发光发热到最后一分钟。
来源：小红书
质粒构建难题频出，犹如玄学
学霸君看完之后，既同情该网友的困境，又暗暗佩服其构建质粒百发百中的能力。毕竟，质粒构建与表达是分子生物学的技术难题，被质粒折磨得苦不堪言的人不在少数。
有人半夜辗转难眠，为质粒实验苦心孤诣，好不容易克服了酶切浓度不够、转化失败的困难，又面临 PCR 之后的条带暗淡无光的挑战。
每一步都严格按照师兄给的步骤严格执行，实验结果却颗粒无收。
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每一个不长菌的培养皿，每一支废弃的离心管，见证了科研人在努力构建质粒时的茫然无措与心塞。
来源：图虫创意
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有人欲哭无泪，给别人构建重组质粒时百发百中，给自己构建质粒时，换了三个载体始终得不到想要的结果。幸运是有的，但不多，全部转移给他人了。
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有人花费半年的时间构建一个简简单单的质粒，却始终敲不开成功的大门，就在最后一次打算放弃时，随便挑了三个菌落测序，意外地一次性成功。
踏破铁鞋无觅处，得来全不费工夫，不得不说这是一门玄学。
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质粒构建和表达有绝招，细节必不可少
细节决定成败，质粒构建、转化、提取、鉴定、转染、测定一条龙过程结束，严格贯彻「细节为先」尤为重要，方能提高实验成功率。
首先，要熟悉目的质粒的构造和细节，做到有的放矢。世界上有无数种质粒, 天然存在的、人为改造的 …… 形态和功能数不胜数，让人眼花缭乱。
但质粒就像好比人，再复杂的「人」都由「鼻子+眼睛+嘴巴+耳朵」构成，换而言之，再复杂的质粒都由「起始位点+启动子+酶切位点+外源片段」等基本元件构成。
学霸君在此推荐以下方法让你先人一步掌握质粒细节：
1. 使用 Vector NTI 软件，里面含有大量常见和经典的质粒图谱，能够对质粒图谱了解更直观。
2. 查找质粒图谱的网站，能够对质粒的来源、构造和功能充分掌握。
Addgene 网址：http://www.addgene.org/
来源：Addgene
Vector DB 网址：http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html
NCBI 网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
欧洲分子生物学实验 EMBL：http://www.ebi.ac.uk/
其次，需要提醒的是，很多人的实验止步于提纯 DNA 这一步，使得前期工作付诸流水。通常，按得到质粒 DNA 的量可将质粒抽提方法和试剂盒分为小提，中提，大提。
做实验严丝合缝地按照步骤执行是严谨的体现，但是有时候也要在不违背主体原则下灵活地改变，例如，在提取质粒时，根据菌液量、实验目的等需要，灵活地选择合适的提取方案，才能获得浓度达标的 DNA，有效快速地推进实验。
毕竟，DNA 浓度直接关系到酶切、酶连、转化等一系列关键步骤，科研小伙伴不得不提起十二分精神。
来源：MCE 官网
此外，学霸君曾受转化步骤困扰，涂菌后的培养皿比脸还干净。经验丰富之后，才知道其中玄机满满。
失败原因：转化后涂菌太少。
改进措施：将摇好的菌离心弃上清, 取沉淀的一半涂板，尤其是构建质粒时, 也可沉淀全部涂板。
失败原因：转化后摇菌时间过短。
改进措施：适当增加摇菌时间，12-14 小时为佳。
失败原因：感受态失效或错误使用。
改进措施：切勿反复冻融，切勿剧烈振荡。
失败原因：抗生素加的比例过多或过少, 长出杂菌。
改进措施：细心认真地确认抗生素的添加是否正确，设置对照组。
东风借力，获得令人安心的质粒
质粒构建看似简单，实则每一步暗含玄机，稍有不慎，连累整个实验进程。之前有研究显示，近 50% 的实验室质粒存在明显的设计缺陷及序列错误。
东京医科牙科大学某博士因错误的质粒被撤销了博士学位，还有人因质粒使用不当被撤稿。这都是血泪教训！
来源：东京医科牙科大学官网，撤销博士学位声明
俗话说，他山之石，可以攻玉。除了自己努力构建质粒之外，学霸君在这里为大家推荐一个巧妙实用、事半功倍的方法，为方便迅捷地获得目的质粒保驾护航。
Addgene 是一个全球性的、非营利性的生物资源储存库，帮助科学家分享质粒的优质平台。它收藏了来自世界各地的 6109 个实验室的 146411 个质粒，其中包含 895 种即用型病毒载体和 214 种重组抗体。
重要的是，这些质粒被来自 111 个国家的科学家们充分利用，已经被请求使用 2128046 次。
来源：Addgene 官网
此外，该平台还提供质粒寄存服务，当科学家发表研究论文时，他们可以将相关的质粒寄存在 Addgene，由 Addgene 提供质量控制、购买资质审核，签署合规性文件、产品运输和记录保存等服务，免去了科研人互相联系和邮寄质粒的滞后性，将其从繁琐的事务中解放出来。
这些被记录到科学论文里的质粒们远渡重洋，走遍世界，为人类科研事业的进步增砖添瓦。
例如，在平台上能看到基因编辑先驱之一张锋院士实验室的经典质粒，后面还贴上了文献来源 — 在 Science 杂志发表的研究论文 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells，令人一目了然，工作效率翻倍。
当然，这些质粒的使用仅限学术机构和非营利组织哦，小伙伴们在使用院士同款质粒时，也要爱惜个人学术羽毛，不能随意用其从事商业活动。
来源：Addgene 官网
来源：Addgene 官网
质粒构建非一朝一夕的功夫，还得仔细揣摩，愿小伙伴们构建一个成功一个。大家还有什么经验要分享吗？欢迎在留言区讨论。
题图来源：图虫创意
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