这是一项关于，饲料菠萝蛋白酶对对虾AHPND，及其他弧菌相关疾病的有效性研究。
从菠萝中提取的菠萝蛋白酶植物化学物质作为减轻对虾养殖中急性肝胰腺坏死病（AHPND）的植物技术解决方案。
南美白对虾（Penaeus vannamei）的无特定病原体（SPF）虾苗的广泛使用，大大减少了许多病毒疾病的载体。然而，细菌性疾病仍然是一个问题，并限制了许多养虾场的生产力。近年来，一种被称为急性肝胰腺坏死病（AHPND）的细菌性疾病的出现，给对虾在生长阶段造成了重大的经济损失。它首先在中国（2009年）被发现，并在未来三年内依次在越南、马来西亚和泰国发现，然后传播到墨西哥（2013年）和菲律宾（2014年），然后在2016年在南美和韩国、2017年在孟加拉国和美国以及2020年在哥斯达黎加被报告。AHPND是一种跨国家和大陆传播的传染病，是对虾养殖世界的细菌性流行病。
AHPND的出现导致了亚洲抗生素使用的增加，因此，据报道，引起AHPND的细菌对多种抗生素表现出耐药性，包括：副溶血弧菌中质粒介导的四环素耐药性。由于与过度使用抗生素相关的环境和人类健康问题，植物饲料添加剂，越来越被视为抗生素的潜在替代品。
各种植物提取物，减轻虾体内AHPND的功效是由于其各种生物活性化合物的作用，我们最近调查了菠萝（Ananas comosus）提取物的潜力；菠萝提取物中存在的普遍生物活性化合物是菠萝蛋白酶，研究报道菠萝蛋白酶在其他人类健康促进益处中表现出各种酶促、抗水肿、抗血栓和抗炎活性。
在动物营养中特别感兴趣的是菠萝蛋白酶的抗菌特性，据报道可以抑制肠道病原体，如：霍乱弧菌和大肠杆菌的生长；菠萝蛋白酶抑制细菌毒素的产生，从而防止大肠杆菌和霍乱弧菌在动物中引起的腹泻。尽管确切的作用方式尚不清楚，但人们推测菠萝蛋白酶的这种作用是通过与肠道分泌信号通路相互作用或由于抗粘附作用而实现的，可能是通过蛋白水解改变受体位点，阻止病原菌附着在肠粘膜上的受体上。
一、喂养试验和疾病挑战：
1、使用一种商业虾饲料（Post Larva II crumble#902， Gold Coin Speciality Ltd.，马来西亚）作为基础配方生产了四种实用饲料。使用一种商业虾饲料作为基础使我们能够评估菠萝蛋白酶的实际潜在功效，如果它被添加到商业饲料中。商业虾饲料在被重新造粒之前被研磨成细粉。阳性（posCON）和阴性（gnCON）对照饲料由添加颗粒粘合剂的重新造粒的商业虾饲料组成（Pegabind®，Bentoli农业营养有限公司，泰国）。只有喂食posCON饲料的虾后来被副溶血弧菌（VPAHPND）挑战。另外两种含有1%（1%BM）或2%（2%BM）菠萝蛋白酶粉末的饲料（澳大利亚布里斯班安纳塔拉生命科学有限公司）也被制粒。对照饲料没有添加BM。
2、四组虾每天用各自的饲料手工喂养3次，直到明显饱腹，持续28天。生长试验完成后，再进行疾病挑战试验。
图1：饲养试验、缓冲期、AHPND激发试验和采样时间表的示意图。BM=菠萝蛋白酶；posCON=阳性对照；gnCON=阴性对照；PL=虾苗。
采用浸泡法进行病害挑战。来自posCON、1%BM或2%BM组的虾被放置在含有150 mL VPAHPND培养物（108 CFU/mL）的1升锥形烧瓶中15分钟（曝气）。然后，将包括虾在内的细菌悬浮液直接倒回含有干净人造海水的各自水池中。包括阴性对照处理（ineCON）作为环境控制，虾不接受VPAHPND挑战，而是浸泡在无菌胰蛋白酶大豆汤中，外加1.5%NaCl。每三小时观察一次所有虾，以监测总临床症状和死亡率。
二、菠萝蛋白酶的功效：
1、添加菠萝蛋白酶的饲料对虾的生长性能比对照组有所提高。特别是，饲喂2%BM的对虾的终重、增重百分比、日增重、比增长率和采食量均明显高于饲喂对照组。
2、在两次疾病挑战试验中，ineCON（未接受AHPND挑战组）显示了95%-98%的虾存活率，这证实了本研究中使用的实验系统没有明显地对虾造成压力或使它们容易受到不必要的死亡。在第一次AHPND挑战中，喂食1%BM饲料的虾显示了最高的存活率（84.8±3.8%），其次是2%BM（78.3±2.5%），与posCON组（69.5±1.8%）相比，两者都显着高于posCON组（69.5±1.8%）（图2）。在再次挑战AHPND的虾（第二次AHPND挑战）后，先前喂食1%或2%BM的虾明显出显着更高的存活率，分别为71.1±9.7%和73.3±3.8%，而posCON组的存活率最低，为51.1±2.2%（图2）。
图2：南美白对虾在第一次和第二次AHPND疾病挑战中10天以上的累计存活。
3、结果表明，与posCON组（18.5%）相比，添加2%BM明显降低了第一次和第二次AHPND挑战之间的平均存活率差异（3.5%），而1%BM喂食的虾为14.4%。考虑到第一次和第二次AHPND挑战之间的虾存活率差异约为3.0%，在第二次疾病挑战期间观察到的2%BM组虾死亡率的小幅增加可能不是由于AHPND本身。虾的死亡率是由受损的肝胰腺引起的（图3）。
图3：AHPND侵袭南美白对虾肝胰腺的横切片。
三、胃微生物群：
1、肠道微生物群已知参与对虾健康和疾病的调节。根据辛普森指数，喂养补充BM饲料的VPAHPND感染虾的胃细菌群落显示出最高的α多样性。辛普森指数表明ASV（扩增子序列变体）的数量很高，ASV的比例更相似。posCON组的细菌多样性是所有组中最低的，与未受挑战的内孔组虾相比，细菌多样性受到抑制。
2、在门类水平上，所有处理组的细菌群落结构主要由相对丰度的变形杆菌、放线菌和拟杆菌组成（图4）。与未受挑战的negCON组相比，posCON组的软壁菌门和拟杆菌相对丰度增加，放线菌相对丰度减少。与posCON组相比，喂食1%BM饲料的虾胃中的细菌群落显示，疣微菌和浮霉菌的相对丰度增加，软壁菌门的相对丰度相应减少。对于2%BM组，观察到胃中变形杆菌的明显富集，而软壁菌门的相对丰度减少。
图4：不同处理组细菌门的平均相对丰度[阴性对照（ineCON）、阳性对照（posCON）、1%菠萝蛋白酶（1%BM）和2%菠萝蛋白酶（2%BM）]。每个细菌门在条形图中表示为不同的颜色。
细菌属的丰度增加，被确定为区分1%BM和2%BM组与对照组的具有统计学意义和生物学信息量的特征之一（图5）。
图5：在虾胃中确定为区分菠萝蛋白酶实验组和非菠萝蛋白酶处理组[阴性对照（ineCON），阳性对照（posCON）]的统计学和生物学信息特征之一的细菌属LuteoliBacter的丰度。
图6：虾胃中添加菠萝蛋白酶组（1%和2%BM）和对照组（ineCON和posCON）之间细菌属弧菌的丰度。
四、菠萝蛋白酶的潜力：
1、菠萝蛋白酶是一种酶复合物，由不同的肽酶与其他次要成分如磷酸酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、糖蛋白、碳水化合物等的混合物组成。菠萝蛋白酶是菠萝中存在的主要氢基蛋白水解酶。商品菠萝蛋白酶大多从菠萝的茎和果实中提取，但也可以从菠萝废料如叶、果皮和果冠中少量分离。茎菠萝蛋白酶（EC3.4.22.32）已知与水果菠萝蛋白酶（EC3.4.22.33）相比，表现出不同的生化特性、生物活性和组成。因此，与菠萝蛋白酶进行的研究比较应考虑菠萝的哪一部分用于提取，菠萝蛋白酶产品的合成酶活性、组成和纯度。此外，使用各种菠萝部分的粗提取物代替纯化菠萝蛋白酶进行的研究还将含有其他次要的生物活性化合物，如皂苷、黄酮类化合物、生物碱和单宁，这些化合物可能会影响研究结果。
2、目前关于饲料BM对水生动物生长性能的影响的信息很少。目前的生长试验表明，在白对虾饲料中补充菠萝蛋白酶通常增强了生长性能，特别是在2%BM日粮水平上。而且，添加高达2%的菠萝蛋白酶的饲料不会导致任何饲料适口性或毒性问题，具有优良摄食性和FCR观察到的虾的高存活率证明了这一点。喂食添加BM饲料的虾的生长性能改善可能部分归因于虾的健康状况改善。本研究中观察到的其他有助于生长改善的因素可能包括营养消化率的增强和肠道形态的有益变化，这将允许更好的营养吸收。
3、本研究是关于饲料菠萝蛋白酶在减轻对虾AHPND和可能的其他弧菌相关疾病中的有效性的首次报告。在两次AHPND挑战试验后，先前喂食添加BM的饲料的对虾肝胰腺中的弧菌计数和可培养细菌总数明显低于阳性对照。喂食添加BM的饲料的对虾胃中弧菌的患病率也明显低于posCON（图6）。
总之，本研究表明，通过使用植物化学物质（菠萝蛋白酶）来改善肠道微生物群，可以替代有害的广谱抗生素，用于养殖对虾对抗AHPND和可能的其他弧菌疾病的疾病管理。基于这些实验室结果，我们建议饲料菠萝蛋白酶的添加水平为2%，以增强生长性能和对AHPND的抗病性。