编辑丨王多鱼
排版丨水成文
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，简称为PA）是一种重要的革兰阴性机会致病菌，常见于创伤、烧伤及呼吸机相关肺炎患者，并具有较强的内在和获得性耐药能力，是抗微生物耐药相关死亡的重要病原体之一。
老年人是铜绿假单胞菌感染的高风险人群。临床研究显示，高龄患者发生铜绿假单胞菌血流感染后，短期死亡风险明显升高。与此同时，随着年龄增长，人体会出现免疫衰老，表现为 B 细胞和 T 细胞功能下降、疫苗诱导的抗体水平降低，以及免疫记忆维持时间缩短，这给老年人群的疫苗研发带来了额外挑战。
自组装蛋白纳米颗粒能够以高度有序、多价的方式展示抗原，促进抗原呈递细胞摄取并增强免疫反应，因此被广泛用于新型疫苗设计。然而，纳米疫苗使用的载体本身也会诱导免疫反应。已有的抗载体抗体可能加速载体清除，或者使免疫系统过度关注载体，削弱针对目标抗原的应答，这一现象被称为载体诱导的表位抑制（carrier-induced epitope suppression，简称为 CIES）。
能否让纳米载体本身也成为保护性抗原，从而将原本可能有害的抗载体免疫转化为额外的抗菌保护？
近日，陆军军医大学国家免疫生物制品工程技术研究中心顾江、邹全明团队（李宇航为论文第一作者）在纳米科技领域国际权威期刊ACS Nano上发表了题为：Protective-Antigen Scaffold Nanoparticle Vaccine Overcomes Carrier-Induced Suppression and Immunosenescence to Protect against Pseudomonas aeruginosa Pneumonia 的研究论文。
该研究开发了一种以保护性抗原为支架的纳米疫苗平台。研究团队基于蛋白质结构数据和生信分析，筛选到保护性的铜绿假单胞菌伴侣蛋白GroEL作为能够自组装的纳米支架，并将 PcrV-OprI 融合抗原 rePO 展示在GroEL纳米颗粒上，构建出reGroEL-PO纳米疫苗。
与传统纳米载体不同，不仅抗 GroEL 的载体效应本身具有保护效果，而且预先存在的抗 GroEL 免疫不仅没有抑制针对 rePO 的抗体反应，反而进一步增强了抗原特异性免疫。该疫苗还能够促进抗原呈递细胞摄取和树突状细胞成熟，加速体液与细胞免疫反应，并在成年和老年小鼠模型中减轻铜绿假单胞菌肺炎。
在这项研究中，研究团队首先从铜绿假单胞菌蛋白组中筛选了9 种具有自组装潜力的蛋白。小鼠感染实验显示，在这些候选蛋白中，只有重组 GroEL能够显著提高致死性铜绿假单胞菌肺炎模型中的小鼠生存率，同时降低肺部细菌负荷、炎症因子水平和组织损伤。
这意味着 GroEL 不仅能够形成纳米结构，其本身也是一种具有免疫保护作用的抗原。
在此基础上，研究团队将 rePO 抗原与 GroEL 融合，构建了 reGroEL-PO 纳米颗粒。动态光散射结果显示，其平均水合粒径约为26.69 纳米；透射电子显微镜观察到颗粒呈相对均一的“糖果状”结构。经过零下 80 摄氏度保存6 个月后，该纳米颗粒仍能维持稳定的粒径分布，且纳米化并未削弱 rePO 与特异性抗体的结合能力。
随后，研究团队建立了预存抗载体免疫模型，比较 GroEL 与常用铁蛋白纳米载体的差异。结果显示，在预先接受铁蛋白免疫的小鼠中，铁蛋白载体上的 rePO 抗原所诱导的抗体反应明显受到抑制，其第 7、14 和 21 天的抗体水平分别下降至未预免疫小鼠的0.39、0.14 和 0.30 倍。
与之相反，预先存在的抗 GroEL 免疫并未抑制reGroEL-PO 的免疫原性。预免疫小鼠的抗 rePO 抗体水平反而分别提高至未预免疫小鼠的3.33、1.82 和 1.80 倍。加入 AS03 佐剂后，这种增强效应更加明显，第 7、14 和 21 天的抗体水平分别提高至16.00、7.11 和 5.34 倍。
也就是说，GroEL 将传统载体容易面临的“抗载体免疫负担”，转化成了促进目标抗原应答的免疫助力。
机制研究显示，reGroEL-PO 能够显著增强树突状细胞和巨噬细胞对抗原的摄取。超过 90%的巨噬细胞能够摄取含有 GroEL 的纳米颗粒，其进入细胞主要依赖吞噬作用和脂筏介导的内吞途径。
reGroEL-PO 还能促进树突状细胞表达 CD80 和 CD86 等共刺激分子，激活 Toll 样受体、NF-κB 和 TNF 等免疫相关通路，并促进引流淋巴结中生发中心 B 细胞形成。免疫后小鼠同时出现 IL-4、IFN-γ 和 IL-17A 分泌细胞增加，表明该疫苗能够诱导以 Th2 反应为主、同时包含Th1 和 Th17反应的复合型免疫。
在成年小鼠模型中，接受 3 次免疫的 reGroEL-PO 组在致死剂量铜绿假单胞菌攻击后实现了100% 的生存。当免疫次数减少至2 次时，reGroEL-PO 组仍保持100% 的生存率，而 rePO、GroEL 及两者物理混合组的生存率分别为 30%、0% 和 50%。
在亚致死感染模型中，reGroEL-PO 还显著降低了肺部细菌负荷和 IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α 等炎症因子水平，减轻肺组织充血、水肿、炎症细胞浸润及肺泡结构破坏。面对多种临床分离株，该疫苗同样表现出较广泛的保护作用。
为了检验其克服免疫衰老的能力，研究团队进一步使 用23 月龄老年小鼠开展实验。reGroEL-PO 免疫后第 7 天即可诱导明显的抗体反应，并在第 2 次免疫后达到较高水平。感染铜绿假单胞菌后，免疫小鼠的肺部细菌负荷、促炎细胞因子水平和组织损伤均明显降低。
单细胞RNA测序进一步显示，reGroEL-PO 能够显著增加老年小鼠引流淋巴结中的经典 Ⅰ型树突状细胞（cDC1）。这类细胞擅长交叉呈递抗原，并参与 Th1 及细胞毒性 T 细胞反应，可能是该疫苗在免疫衰老条件下仍能快速建立保护的重要原因。
短期安全性实验中，reGroEL-PO 在最高200 微克/毫升的测试浓度下未引起明显溶血或细胞毒性。免疫小鼠的血常规指标处于正常范围，心、肝、脾、肺和肾等主要器官也未观察到明显的处理相关损伤。
该研究的核心发现：
铜绿假单胞菌GroEL兼具自组装纳米支架和保护性抗原的双重功能；
预先存在的抗 GroEL 免疫不会引起载体诱导的表位抑制，反而可增强针对 rePO 的抗体反应；
reGroEL-PO能够促进抗原摄取、树突状细胞成熟、生发中心形成及 Th1、Th2、Th17 协同免疫；
reGroEL-PO 在成年和老年小鼠中均能快速建立针对铜绿假单胞菌肺炎的保护；
以保护性抗原作为纳米支架，可能为其他细菌疫苗的设计提供一种可推广的新策略。
总的来说，该研究开发了一种以保护性抗原 GroEL作为支架和免疫原的自组装纳米疫苗。该设计不仅绕过了载体诱导的免疫抑制，还利用抗载体免疫增强抗菌保护，在成年和老年小鼠中诱导了快速、广泛的免疫应答，并显著减轻铜绿假单胞菌肺炎。这项研究为耐药细菌疫苗及老年人群疫苗的设计提供了一种新的思路。
论文链接：
https://doi.org/10.1021/acsnano.6c04456