导读：自COVID-19大流行爆发以来，全球累计确诊病例已超数亿，死亡人数达数百万，给人类社会带来了沉重的负担。在这场全球性的公共卫生危机中，疫苗接种被视为控制疫情的关键策略。随着新冠病毒的常规化管理，有必要开发针对变异株的广谱性疫苗。
小编将深入解读深圳湾实验室与清华大学医学院联合发表于Nature Communications（IF：14.7）的一项研究“An mRNA-based T-cell-inducing antigen strengthens COVID-19 vaccine against SARS-CoV-2 variants”。该研究聚焦于开发一种创新的mRNA疫苗，其核心创新点在于编码富含人类HLA-I表位的肽段（HLA-I epitopes，HLA-EPs），以此诱导强大的细胞免疫反应，为应对新冠病毒变异株带来了新的希望。
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2023年5月
影响因子：14.7
应用技术：生物信息学分析技术（NetMHCpan和IEDB）、细胞培养、流式细胞术、酶联免疫斑点试验、细胞因子染色、动物模型构建、病毒攻毒实验、组织病理学检测、mRNA构建与修饰、LNP包封、ELISA测定、qRT-PCR、病毒中和试验
01
鉴定HLA-I表位富集肽段
如图1a所示，研究人员运用生物信息工具（NetMHCpan和IEDB）预测了SARS-CoV-2蛋白组中78种最常见HLA-I等位基因的表位，筛选出每100个氨基酸含有20个以上预测有效表位（IC50＜10 nM）的4个片段，包括非结构蛋白（Nonstructural protein，NSP）-3(1443-1605)、NSP-4(232-444)和NSP-6(1-201)和膜蛋白Membrane（M）(1-113)（图1b、c）。其中，NSP-3(1443-1605)、NSP-4(232-444)和NSP-6(1-201)具有高度免疫原性，因此能够激活人类细胞毒性T淋巴细胞反应（图1d、e）。
图1从COVID-19康复患者中鉴定激活CD8+ T淋巴细胞的富含HLA-I表位的肽段
02
评估HLA-EPs在小鼠中的免疫原性
为了验证这些肽段的免疫原性，研究团队构建了基于mRNA的重组抗原（图2a），并将其封装在脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）中, 通过流式细胞术测定HLA-EPs降解效率（图2b，c）。在人源化HLA转基因小鼠中进行接种实验中，接种HLA-EPs的小鼠与接种对照疫苗的小鼠相比，其CD8+T细胞在总T淋巴细胞中的比例显著增加（图2d，e）。这表明HLA-EPs能够有效激活细胞免疫反应，为机体提供针对SARS-CoV-2的免疫保护。
进一步研究发现，免疫接种不仅增加了CD8+ T细胞的数量，还显著扩大了抗原特异性记忆免疫细胞的群体，包括效应记忆T细胞和中央记忆T细胞（图2f，g）。这些记忆细胞在长期免疫保护中发挥着关键作用，能够迅速响应病毒再次入侵，有效控制感染。进一步通过细胞因子检测发现，LNP-HLA-EPs免疫小鼠的脾细胞经HLA -EPs肽池刺激后，产生干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）的表位特异性脾细胞比例显著增加（图2h-j）。
图2HLA-EPs在转基因小鼠中的免疫原性
通过CD8+ T细胞耗竭和活病毒挑战实验，发现LNP-HLA-EPs免疫可降低肺部病毒载量和病理损伤，且该保护作用依赖于CD8+T细胞（图3a-d）。这一结果充分证明了HLA-EPs诱导的细胞免疫反应对预防SARS-CoV-2感染具有重要意义，为疫苗的有效性提供了有力证据。此外，对SARS-CoV-2变异株中HLA-EPs序列分析发现，其在关注变异株中高度保守，虽存在部分氨基酸替换，但不影响基于生物信息学分析预测的表位免疫原性，提示HLA-EPs免疫可能诱导针对已知SARS-CoV-2变异株的广泛保护性细胞免疫反应。
图3 LNP-HLA-EPs对SARS-CoV-2的CD8+ T细胞依赖性保护作用
03
联合免疫策略的卓越效果
选择SARS-CoV - 2 B.1.351变体的RBD构建LNP包封的mRNA疫苗（LNP - RBDβ）（图4a-c），并在HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠中评估HLA-EPs与LNP-RBDβ联合免疫的效果。将小鼠分为3组，分别接种PBS、0.5μg LNP-RBDβ或0.5μg LNP-RBDβ+0.5μg LNP-HLA-EPs，间隔3周免疫两次（图4d）。
图4 SARS-CoV-2 RBDβ表达的验证
结果显示，联合免疫组小鼠淋巴结中C-X-C趋化因子配体13及其受体C-X-C趋化因子受体5表达显著增加（补图5a，b），生发中心B细胞和滤泡辅助性T细胞（T follicular helper，Tfh）细胞频率高于PBS对照组（图5c）；血清中RBD特异性IgG抗体滴度与LNP-RBDβ单独免疫组无显著差异（图5d）。尽管LNP-RBDβ和LNP-RBDβ+LNP-HLA-EPs疫苗接种动物的血清能够中和几种SARS-CoV-2变体，但针对Omicron BA.1变体的中和抗体滴度明显低于针对其他菌株的中和抗体滴度（图5e）。然而，联合免疫组小鼠脾细胞经HLA-EPs和RBDβ肽池刺激后，产生IFN-γ的表位特异性脾细胞数量显著增加（图5f），且IFN-γ和肿瘤坏死因子-α释放细胞频率高于LNP-RBDβ免疫组或PBS对照组（图5g，h），表明联合免疫诱导了更强的抗原特异性免疫反应，且偏向Th1型。
图5 SARS-CoV-2 HLA-EPs和RBD抗原双重免疫对转基因小鼠的保护作用
用SARS-CoV-2 B.1.351变体对免疫小鼠进行攻毒实验，发现联合免疫组小鼠肺部和气管中的病毒载量显著低于PBS对照组和LNP - RBDβ单独免疫组，病理损伤也明显减轻（图6a，b）。用Omicron BA.1变体攻毒时，LNP - RBDβ单独免疫组小鼠肺部病毒载量较高，而联合免疫组小鼠几乎检测不到感染性病毒（图6a，c），且病理损伤轻微。此外，联合免疫组小鼠中CD8+ T细胞耗竭会消除对SARS-CoV-2 B.1.351或B.1.1.529感染的保护作用，进一步证实联合疫苗设计的优势依赖于细胞免疫。
图6 疫苗对SARS-CoV-2 B.1.351和Omicron BA.1变体的保护效果
04
非人类灵长类动物实验验证
为了进一步评估联合免疫策略的有效性和安全性，研究人员在恒河猴中进行了实验（图7a，b）。结果显示，联合免疫能够在恒河猴体内诱导产生高水平的RBD结合IgG和中和抗体，有效中和多种SARS-CoV-2变异株（图7c，d）。同时，联合免疫还显著增强了抗原特异性T细胞反应，产生更多的IFN-γ，且呈现出Th1偏向性的免疫反应（图7e，f）。
在病毒挑战实验中，联合免疫组恒河猴在感染SARS-CoV-2（B.1.351变体）后，其咽喉和肛门拭子中的病毒载量明显低于对照组（图7g），肺部组织中的病毒载量也显著降低（图7h）。这表明联合免疫策略在非人类灵长类动物中同样具有出色的保护效果，为疫苗在人类中的应用提供了重要的参考依据。
图7 非人类灵长类动物HLA-EPs和RBD抗原双重免疫对SARS-CoV-2感染的免疫特性和保护作用
05
结语
本研究开发了一种基于mRNA的T细胞诱导抗原（HLA-EPs），与SARS-CoV-2 RBD抗原联合免疫，能有效增强疫苗对新冠病毒变异株的保护效果。通过在人源化HLA转基因小鼠和非人类灵长类动物中的实验证明，联合免疫可同时激活体液和细胞免疫反应，为控制新冠疫情提供了重要的理论依据和实践指导。未来研究可考虑开发将HLA-EPs与SARS-CoV-2全长刺突蛋白结合的mRNA疫苗，以进一步优化新冠疫苗设计，为全球抗疫提供更有力的武器。
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参考文献
[1]Tai W, Feng S, Chai B, Lu S, Zhao G, Chen D, Yu W, Ren L, Shi H, Lu J, Cai Z, Pang M, Tan X, Wang P, Lin J, Sun Q, Peng X, Cheng G. An mRNA-based T-cell-inducing antigen strengthens COVID-19 vaccine against SARS-CoV-2 variants. Nat Commun. 2023,23,14(1): 2962.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice