【第四届检验与临床（感染性疾病）案例展示全国决赛稿件】
作者 |邓一脉1，顾晨2
单位 |1.常熟市医学检验所 临床微生物实验室，2.常熟市第二人民医院 手足外科
前 言
患者约两小时前不慎因车祸致右下肢出血畸形，当即感疼痛剧烈，流血淋漓，给予简单包扎后送至我院急诊就诊，X线检查示:右侧外踝骨折，胫骨下端可疑骨折，右膝关节外侧及外踝软组织破损，右侧胫骨平台外侧及外踝软组织异物。为求进一步诊治，急诊拟“右膝、踝皮肤软组织缺损，右侧外踝开放性骨折伴骨缺损，右侧股骨外侧髁骨缺损，右腓总神经损伤，右小腿外侧皮肤擦伤”收入病房。
入院诊断右膝、踝皮肤软组织缺损，右侧外踝开放性骨折伴骨缺损，右侧股骨外侧髁骨缺损，右腓总神经损伤。入院期间多次行外科手术，住院期间创面每日用庆大霉素盐水冲洗及清洁换药，结合抗感染补液等综合治疗，创面情况虽然有所好转，但仍有渗出，伤口不愈合。
5月16日创面分泌物细菌培养的结果为镰刀霉属，究竟是病原体还是污染菌？如果是病原体，是否就是导致创面不愈、渗出的原因？应该进一步采取怎样的治疗方案？如果是污染菌，那么污染源来自哪里？应该如何避免该类污染发生的可能性？
案例经过
如前所述，患者约两小时前不慎因车祸致右下肢出血畸形，当即感疼痛剧烈，流血淋漓，给予简单包扎后送至常熟市第二人民医院急诊就诊，X线检查示：右侧外踝骨折，胫骨下端可疑骨折，右膝关节外侧及外踝软组织破损，右侧胫骨平台外侧及外踝软组织异物。
为求进一步诊治，急诊拟“右膝、踝皮肤软组织缺损，右侧外踝开放性骨折伴骨缺损，右侧股骨外侧髁骨缺损，右腓总神经损伤，右小腿外侧皮肤擦伤”收入病房。患者发病以来无头痛、呕吐，无昏迷及抽搐，无发热，大小便正常，并否认高血压及糖尿病病史。
住院46天中前后行清创探查骨折支架外固定+创面VSD负压吸引术，扩创更换VSD+腓总神经探查术，阔筋膜重建外侧关节囊外侧副韧带+股前外侧岛状皮瓣逆行修复膝关节外，侧皮肤软组织缺损+髂骨重建外踝钢钢板固定术+胫后动脉穿支皮瓣修复外踝皮肤软组织缺损，扩创游离植皮+小腿近端局部转移皮瓣+足背带蒂皮瓣移植术等。
用药情况为：4月1日至26日为头孢呋辛1.5g bid ，4月27日~5月13日为青霉素640万U q8h。创面分泌物细菌培养结果如下：4月5日产碱假单胞菌，4月14日无菌生长，4月20、26日及5月6日粪肠球菌，5月11日无菌生长 ， 5月16日镰刀霉属，5月23日无菌生长。
镰刀菌一般入侵免疫缺陷病人造成相关疾病，该病患入院后查血常规正常（粒细胞数值及占比均正常），无免疫缺陷相关病史，但镰刀菌广泛存在于自然界中，该患者是车祸外伤病人，存在暴露史，因此于6月2日病人返院换药期间，经沟通协调，采集血液标本，进行需培养和G、GM实验，并采集组织标本直接镜检+培养，病理活检等。
通过直接组织标本镜检和组织病理活检，镜下均观察到真菌菌丝等，培养数天后长出菌落，经质谱仪鉴定为茄病镰刀菌复合群，组织标本直接宏基因组二代测序亦为镰刀菌属，最终确诊为茄病镰刀菌复合群局部感染感染。
患者经泊沙康唑静滴一个月后口服序贯，目前伤口愈合较好。
检验案例分析
（一）一般检查：血常规正常，血糖正常，术前传染性指标（艾滋病、病毒等）均为阴性。暂无提示存在免疫缺陷相关疾病。
（二）微生物培养：创面分泌物微生物培养结果如下：4月5日产碱假单胞菌，4月14日无菌生长，4月20、26日及5月6日粪肠球菌，5月11日无菌生长，5月16日镰刀霉属（当时尚未安装微生物质谱仪，直接通过菌落形态和镜下特点来判断），由于首次培养出镰刀菌且为外伤患者，担心存在污染的可能性，所以联系临床重新取样（创面分泌物），5月23日无菌生长。那么，5月16日培养出的镰刀菌究竟是不是该患者创面迁延不愈的病原体呢？
（三）为明确诊断，采集组织标本检查，结果如下：
1.组织标本直接镜检：采集三个不同部位的组织标本，直接用棉酚兰染液染色后镜检观察，高倍镜下直接可观察到真菌菌丝及疑似镰刀菌孢子。（图1）
图1
2.组织标本真菌培养：采集组织标本后接种在沙保罗平板上，并置于温度为35.5℃、CO2浓度为5.0%的培养箱中。在采样后的第三天，沙保罗平板上长出真菌菌落，肉眼观察，菌落质地较为柔软，呈白色绒毛状，边缘清晰，中心着色深而外缘着色浅。
棉酚兰染色后，高倍镜下可见菌丝和大、小孢子，都具有分隔，小孢子短而呈椭圆形，有一个分隔，大孢子有分隔，形似独木舟，是镰刀菌的典型特征。（图2）此时微生物室刚启用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），质谱仪鉴定结果为茄病镰刀菌复合群（Fusarium solani complex）。（图3）
图2
图3
3.镰刀菌药敏结果：镰刀菌对棘白菌素和氟康唑是天然耐药，两性霉素B和伏立康唑均敏感的。
4.组织mNGS：将组织标本送检mNGS，结果提示镰刀菌属，序列数1265，相对丰度98.21%。（图4）
图4
5. G实验、GM实验、血培养：均为阴性，基本排除了镰刀菌全身播散性感染。
临床案例分析
1.后期又做了组织标本病理活检：镜下可见真菌菌丝、化脓性炎，大片坏死渗出组织，肉芽组织和少量纤维结缔组织。（图5）
图5
2.结合病人病史、症状、体征及实验室检查结果，患者存在茄饼镰刀菌复合群局部感染，诊断较为明确。虽然病患尚未存在免疫缺陷病症，但是年纪偏大、伤口破损较大，为防止播散性感染，需要积极系统性治疗。
知识拓展
镰刀菌（Fusarium spp），属于菌物界真菌门子囊菌亚门肉座菌科（Hypocreaceae）的赤霉属（Gibberella）、丛赤壳属（Nectria）、丽赤壳属（Calonectria）和小赤壳属（Micronectriella）的有性型真菌。
镰刀菌广泛存在于土壤中和植物上，是一种条件致病菌，临床上常引起角膜炎[1]，引起皮肤感染及深部感染较为少见。正如其他许多土壤真菌一样，它们适应于在土壤中存活，其机能之一是能够在形态学和生理学上对于新的环境具有很快的变化和适应的能力。它们能够生活在广阔范围的深层底土之中，也可以从许多贮存的食物和化学物品中分离出来。
镰刀菌病的临床表现多种多样，与菌种及宿主免疫状态有关，且各个年龄段均可发病，病程长短不一，最长者达22年[2]。皮损可发生在全身任何部位，无特异性。皮损形态呈多形性，可表现为红斑、丘疹、溃疡、结节、疣状增生等，但以溃疡和结节改变最多见。当宿主为免疫缺陷状态时，易发生播散行感染，有相关报道[3]，患者因料爆炸致全身多处烧伤后血流感染层生镰刀菌。
实验研究表明，茄病镰刀菌是条件致病菌，其致病菌密度越高致病性越强[4]，引发感染最主要的原因是有农作物接触史或外伤史，当被污染的植物枝叶或土沙等伤及角膜，真菌即有机会侵入，引发感染[5]。有相关报道[6]，患者因皮肤长时间接触灼热地面而导致烧伤并发生镰刀菌感染。
微生物学检查及组织病理学检查有助于真菌感染的诊断，一般而言，要在组织内找到真菌菌丝、孢子或菌体，才能确诊为深部真菌感染。Josep等[7]曾报道1例艾滋病患者混合感染两种镰刀菌，病理组织切片中也未发现真菌。临床上碰到难治性溃疡、结节伴坏死等皮肤损伤，而常规治疗无效时，应考虑到镰刀菌感染的可能。目前临床对镰刀菌感染研究甚少,尚需更多的临床观察。
镰刀菌感染的治疗目前尚无统一方案。镰刀菌引起的皮肤感染中,免疫功能正常者多为局限性受累，进展缓慢，对治疗反应较好，而免疫功能缺陷者进展迅速，易形成播散性感染，对抗真菌治疗反应较差。
黄玲玲等[2]研究显示，采用局部治疗联合全身抗真菌治疗，能达到较理想的临床治疗效果，患者能有明显好转或痊愈。镰刀菌除了对棘白菌素和氟康唑是天然耐药外，其他抗真菌药物如伊曲康唑、两性霉素B、伏立康唑、特比奈芬等可根据具体的药敏结果来选择使用。
案例总结
本次案例患者以因“车祸致右下肢出血畸形两小时”入院，由于常熟地区尚未发现过镰刀菌感染，且无免疫缺乏相关病症，临床送检的标本只有一次有镰刀菌属的培养结果，且镰刀菌广泛存在于自然界中，极其容易怀疑检出的镰刀菌为污染菌。但是微生物实验室通过不断地跟临床沟通，直接参与临床采集组织标本，联合组织病理活检等，最后锁定了镰刀菌属的局部感染。
本案例提示我们，在发现少见菌检出时，不可用简单的惯性思维做出判断，污染菌或者病原菌均与结合临床，不能局限于检验本专业，应将检验与临床有机结合，才能做出科学严谨的诊断，为患者争取治疗时间的同时，尽力寻求最理想的治疗方案。
专家点评
点评专家：陈洁常熟市医学检验所所长、常熟市临床检验质控中心主任
常熟市医学检验所成立于2010年，是国内首家公立性质的独立医学检验机构，也是苏州大市首家通过ISO15189认证的实验室，率先在区域内实施医学检验资源集约化管理，业务范围覆盖全市公立医疗机构和部分民营医疗机构，实现了常熟市医学检验资源城乡服务均等化。作为区域检验，更是代表了一个地区的检验医学的技术水平。
本案例为开展真菌镜检后，发现的第一株镰刀菌，对本科室微生物检验人员的真菌检测能力具有很大的挑战性。5月6日培养到镰刀菌感染后，作为一种少见菌，科室工作人员在没有质谱仪的情况下，对该菌做出了准确的鉴定结果，而且具备临床思维，能主动联系临床，从创面分泌物到组织标本的选择，到床边直接参与并指导临床采样，再到选择血培养、G实验、GM实验等辅助检验手段，全程参与整个疾病询证过程；
最终确定该名免疫力正常者患者为外伤导致的茄病镰刀菌复合群局部感染，为后期患者的康复治疗争取了时间，具有非常重要的临床意义，也是作为常熟地区微生物检验在检验水平，尤其是真菌检测水平的进步和提高，体现了工作人员严谨求实的科学态度。
此次病例，常熟市第二人民医院组织了MDT讨论，本所微生物实验室也组织了全科培训，对镰刀菌属的生物学特性、临床疾病等都有了深度的认知。通过此次病例的发现和学习，我们更加体会到作为临床微生物实验室在日常工作中的四个要点：
第一，不轻易放过少见菌、少见感染病例，随着检测手段不断更新，以及感染性疾病的复杂性，会检出一些不常见的微生物，我们不能畏难和敷衍，更应该通过探索和学习来填补自己医学知识的盲区；
第二，实验室（微生物、病理等）之间应该加强合作，在面对一些疑难病例时，很多情况光靠检验手段是达不到诊断目的的，但是可以通过其他实验室的检测手段，例如病理、影像等，从这些结果来佐证检验结果，并结合检验结果来更好地服务临床；
第三，临床无菌操作、规范采样是非常重要的，微生物检验最重要的是无菌操作和合理选择临床标本，此次病例就能看出，刚开始是创面分泌物标本，数次创面标本的培养结果不一致，当检出镰刀菌后更是不能准确地判断是否是感染菌，后经微生物工作人员的专业建议，采集组织标本进行镜检和培养，来明确组织感染情况，并且全程无菌操作，杜绝了采样过程中污染的可能性；
第四，也是最重要的，微生物应该积极主动地跟临床沟通交流，在发现疑难或少见菌时，我们需要第一时间取得临床信息，通过采样过程来排除该菌是否存在污染的可能性，通过临床症状的比对来佐证检出微生物是否是感染菌。
同时，通过沟通交流也能了解临床真正的需求，建立信任感，一方面能宣贯微生物标准采样的重要性，从而保证检验前质量，另一方面，也能学习到临床知识，丰富知识体系，建立临床思维，更好地服务临床。
参考文献
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编辑：李玲 审校：笪文武