生物密探 iSpyBio
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抗体分子在没有标记的情况下不能在光学显微镜甚至电镜下观察到。检测系统是对一抗或二抗进行标记，将其靶抗原-抗体结合的位点显示出来。人们已经用过很多标记物，包括与底物反应时能产生有色产物特性的荧光复合物和活性酶标记，然后在显微镜下观察。如果通过适当的处理可产生电子致密物，也可适用于电镜观察；也可采用能直接用于电镜观察的标记物，如金、铁蛋白、病毒颗粒等。 另外，通过信号放大可提高检测系统的敏感性，下面将进一步阐述。
直接连接-标记抗体法
通过化学方法使标记物与抗体结合，然后直接将标记抗体用于检测组织切片的方法（图1），已广泛应用于免疫组织学诊断。
图1.直接连接法（Px，过氧化物酶； F,荧光素）
直接连接法（直接法）具有快速和容易操作等优点。直接标记更适合于单克隆抗体标记。
直接标记抗体的缺点是检测不同抗原时必须分别对一抗进行标记。与间接标记和不标记抗体方法相比，直接标记需要较高浓度的抗体。
间接法或三明治法
间接标记法（间接法）或三明治法（图2）是对直接标记法的改良，
具有以下优点：
1.功能增强，因为标记的抗体可和不同的一抗联合使用。
2.只标记第二抗体。
3.一抗常常可用稀释度高的工作液（与直接标记相比）。
4.由同种动物产生的第二抗体对第一抗体具有较高的特异性和亲和性。
5.该方法能用自身特异性对照，可省去一抗，或用另一种抗体代替一抗，可为各种染色模式提供有效性评估。
图2.间接（三明治）法.（方框内为一抗的抗原决定簇）
所有间接标记法的原理均非常相似；过氧化物酶和荧光间接标记方法如图2所示。抗靶抗原的特异性抗体（如兔抗-A）加在切片上，然后洗去多余的抗体。加上标记的第二抗体（如猪抗兔免疫球蛋白)，其能特异性结合兔抗体的抗原决定簇，标记的二抗与一抗特异结合，而一抗则和抗原结合。
不标记抗体法
1.酶桥接技术
化学结合的缺点可通过将标记的部分只与抗原通过免疫结合而连接的方法予以避免。为达到这一目的，Mason和他的同事们建立了称作酶桥接法的技术。但这一方法目前已很少应用（原理见图3）。
2.过氧化物酶-抗过氧化物酶法
PAP是过氧化物酶-抗过氧化物酶(peroxidase antiperoxidase)的缩写，代表这一染色方法的第三步。PAP法（图4）是第二种不标记抗体的方法，也可避免化学连接的内在问题。PAP系统首先由Sternberger 及其同事用来检测抗螺旋体抗体，据报道该方法比相应的连接法的敏感性高100~1000倍。其原理与酶桥接法相似。
PAP试剂包括以稳定的小的免疫复合物形式存在的抗辣根过氧化物酶抗体和辣根过氧化物酶抗原。典型的复合物结构包含2个抗体分子和3个辣根过氧化物酶分子，如图4所示。
桥接抗体扮演“特种胶”的角色，将PAP的标记部分与第一抗体连接，而第一抗体则和靶抗原连接。这种方法具有较高敏感性和特异性，也有较好的稳定性，目前已广泛应用于常规石蜡切片。
PAP法的缺点之一是结合到PAP的抗体和第一抗体必须来自同种动物。在使用不同的试剂来源时会造成不必要的浪费，如一个试剂盒里的兔PAP不能连接另外一个试剂盒里的山羊一抗，即使使用所谓的广谱桥接抗体（2种或2种以上桥接抗体的混合物液）也一样。为了能将鼠或山羊抗体和兔PAP一起使用，必须采用四步法（图4B），如鼠一抗与兔抗鼠免疫球蛋白连接，接着是桥接抗体，然后是兔PAP。
生物素-抗生物素蛋白法
生物素-抗生物素蛋白法利用了生物素与抗生物素蛋白之间的高亲和性。生物素可通过化学方法连接到一抗上，产生生物素化复合物，当加到组织切片上时，可定位组织切片内的抗原位点。接着加上与辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白；抗生物素蛋白与生物素化的抗体紧密结合，可显示组织切片上与抗原结合的过氧化物酶。这一方法快捷，特别适用于间接标记法(图5B）。
图5.A:直接生物素-抗生物素蛋白法;B:间接生物素-抗生物素蛋白法。（方框内的*代表一抗的抗原决定簇，A,抗生物素蛋白；B,生物素）
该方法存在两个缺点：第一，不同批次的生物素和不同批次的抗生物素蛋白间的亲和性不同，造成不同实验室间该方法的敏感性和稳定性差异很大；第二，有些组织含有较多的内源性生物素，将直接和抗生物素蛋白-过氧化物酶结合，产生非特异性染色（假阳性）。为避免这两个缺点，可通过封闭技术来解决。
抗生物素蛋白-生物素连接（ABC）法
Hsu和同事改良了生物素-抗生物素蛋白系统，大大提高了敏感性。该方法既可用于直接标记法，也可用于间接标记法。在间接标记法中（图6),先加入第一抗体，再加入生物素标记的第二抗体，接着加入预先形成的抗生物素蛋白和生物素辣根过氧化物酶复合物。这一复合物可对存在于抗原部位的辣根过氧化物酶分子进行定位。ABC法染色时间较PAP法短，但与内源性生物素结合的问题仍未解决。
生物素-链卵白素系统
生物素-链卵白素（B-SA）法通过用链卵白素代替抗生物素蛋白，将链卵白素直接与酶分子结合等方法克服了ABC法存在的一些问题。
链卵白素是从链霉菌中提取的分子质量为60kD的四聚体，是抗生物素蛋白的类似物，能以非常高的亲和力和生物素结合。理论上，它们之间的亲和力是多数抗原-抗体之间亲和力的10倍以上，并能提供非常特异的检测手段及放大抗原-抗体间结合的信号。
用链卵白素代替抗生物素蛋白出于以下几个理由：
1.链卵白素不含能和肾、肝、脑和肥大细胞中的植物血凝素非特异性结合的碳水化合物。
2.链卵白素的等电点接近中性，而在生理情况下抗生物素蛋白的等电点为10；因此链卵白素结合不存在生理条件下抗生物素蛋白结合具有的静电非特异性结合。
3.在B-SA方法中，因为酶是直接与链卵白素结合的，试剂的稳定性较高，可稀释成即用型试剂并能长期保存。
在B-SA方法中，可对二抗及标记试剂进行修饰，以使生物素和酶标的数量大大增加，提高检测的敏感性。同时也节省昂贵的一抗用量。过氧化物酶和碱性磷酸酶都可用做酶标。
多价系统
这些系统提供由抗不同种动物免疫球蛋白组成的混合型二抗。这样使得一种二抗既可用于单克隆抗体也可用于多克隆抗体。
1.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法，其原理和PAP法相同（图7）。
图7.APAAP法和PAP法显示用不同一抗和二抗进行双标记的可行性。
APAAP法有三个主要用途：①用于含高水平内源性过氧化物酶的组织的染色，②与过氧化物酶联合使用进行双重染色，③用于那些适合于碱性磷酸酶鲜红色底物的特殊细胞的染色。
碱性磷酸酶标记适用于富含内源性过氧化物酶的组织，如骨髓、髓系细胞浸润的淋巴组织，尤其适用于冰冻切片，因为完全封闭血及骨髓涂片中髓样白细胞的内源性过氧化物酶非常困难，同时封闭可引起一些抗原决定簇变性。
对于双重标记，联合应用APAAP法和免疫过氧化物酶染色方法较为简单。用碱性磷酸酶作为第二标记可以避免使用两种过氧化物酶引起的交叉反应。另外，进行同步双重染色也可应用不同种类抗体，如多克隆和单克隆抗体作为一抗（图7)。用固红和固蓝进行APAAP法双重染色，应注意避免混合颜色染色（即红色变成紫色）；为此，染色较弱的一抗应先染色，第二抗体的孵育时间应较短（10-15分钟，显微镜下观察控制）。
碱性磷酸酶底物产生的鲜红色（固红或新品红）比传统的过氧化物酶染色更清晰。APAAP法也可应用于细胞核的染色或只有少数细胞阳性染色的细胞涂片。与传统的DAB 棕色反应产物相比，APAAP 法的碱性磷酸酶染色剂的红色更清晰。
APAAP法的这种显色优点，可用于碱性磷酸酶结合抗生物素蛋白或链卵白素而改良的ABC或B-SA法。APAAP法复合物由2个分子的抗原（碱性磷酸酶）结合1个分子抗体。这一构象和二价抗体的结合反应相似。APAAP复合物性质稳定，可长时间保存。
有两种方法可增加APAAP标记法的免疫染色强度。第一种方法是“双桥联”技术，也可用于PAP法，即简单地重复免疫染色过程的第二和第三步[加第二(桥联）抗体和标记复合物]。APAAP 法增加敏感性并非是形成双桥联所致，而是由于结合了剩拿的未被结合的一抗。第二种增加敏感性的方法是联合应用APAAP技术和抗生物素蛋白-生物素-碱性磷酸酶复合物(ABAP)技术。这种放大过程是在一抗孵育后，相继加入生物素化抗鼠1gG(Vector)和鼠APAAP(DAKO)，然后加入ABAP复合物(Vector)标记。
2.酶标记抗原法
酶标记抗原法是免疫过氧化物酶法中最具特异性的方法。它的应用原理如图8示。只用一种抗体，该方法利用抗体分子具有两个化合价，一个在研究条件下可和靶抗原结合，另一个则可和后加抗原结合，它就是和辣根过氧化物酶连接的抗原。因而此法是抗原标记过程。
图8.标记抗原法
此法所需第一抗原的工作浓度相对较高，一抗的用量较大，因此用于抗原和抗体来源丰富的抗原检测。该法的一个主要优点是一抗纯度要求不高，用这种方法，与组织结合的非特异性的抗体不会被检测出来；由于缺乏对A抗原特异性，也不会和A抗原-过氧化物酶复合物结合，因而不能检测出来。
该方法适用于用2个标记抗体（如k-过氧化物酶和~-碱性磷酸酶）同时检测同一切片上的2种抗原的双标技术(图9）。
图9.标记抗原双重染色。2个不同的抗体分别识别组织切片中各自的抗原，然后只和相应的标记抗原结合（用过氧化物酶Px或碱性磷酸酶AP标记）
除此之外，还有多聚体标记二步法、酪氨酸信号放大系统、蛋白A法、ImmunoMax技术等。
对于免疫组织化学染色方法，人们一直在不断寻求新的、更敏感可靠、更简单的方法，试图在不影响敏感性的情况下简化传统多步骤检测系统，缩短染色时间。在实际工作中，实验步骤减少时，敏感性也会降低。新的方法，如催化沉淀法或酪氨酸信号放大(TSA)、免疫多聚酶链反应（Immuno-PCR)和终产物放大等方法虽提高了检测的敏感性，但同时增加了检测过程的复杂程度，并常常产生过高的非特异性染色。也有人尝试利用天然或合成多聚体载体增加和改变连接抗体配对的酶或配体的数量的方法优化检测方法。
最后，Biorbyt温馨提醒：应用任何所谓的“超敏感”检测系统均应注意尽可能稀释一抗的有效工作浓度，以避免非特异性染色。