面包是以小麦粉为主要原料的一类发酵焙烤食品，在人们饮食生活中占有重要地位。酸面团是一种古老而传统的面包发酵剂，其中的微生物成分复杂，微生物之间相互作用可生成大量风味物质。酵母对酸面团及面包品质和风味的影响较大。
食品质量与安全北京市实验室沈鑫、杨海莺、吕莹*等人 采用分离自北京、山东、河南和福建本土特色老面团的酵母菌，与商业酵母菌对比，使用高效液相色谱法探究不同酵母菌对糖及有机酸的代谢能力，通过比容、质构测定等方法探究不同酵母菌对酸面团面包品质的影响，同时，结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和感官评价，探究不同酵母菌对酸面团及面包风味的影响，以期筛选出发酵特性优良的酵母菌，为开发品质良好、风味独特的面包产品提供理论基础。
1.不同酵母对酸面团糖及有机酸的代谢
小麦在制粉时，由于机械的碾压作用，淀粉颗粒破裂，释放出约5%～8%的破损淀粉。破损淀粉在
-淀粉酶和-淀粉酶的作用下被分解为糊精、双糖和少量单糖，为酵母菌生长代谢提供所需碳源，并有助于酵母菌产生乳酸和琥珀酸等有机酸类物质。
从图1可以看出，与商业酵母L相比，酵母Y-1、酵母Y-3、酵母Y-4和酵母Y-5都表现出较好的糖代谢能力，其中酵母Y-1、Y-3糖代谢能力最强，酸面团中果糖含量分别为（0.60±0.03）、（0.65±0.04）mg/g，蔗糖含量分别为（0.63±0.03）、（0.63±0.02）mg/g；葡萄糖含量分别为（0.46±0.03）、（0.48±0.03）mg/g，说明这2 种酵母可以更好地利用发酵基质中的营养成分进行生长代谢，适宜进行面团的发酵。
由表3可知，所有酸面团pH值在4.56～4.87之间，TTA在2.33～4.73 mL之间，其中酵母Y-2制作的酸面团pH值最低，TTA最高，说明酵母Y-2产酸能力最强，但产酸能力强并不能代表该酵母对酸面团品质具有积极影响，还需结合有机酸种类及浓度进一步分析。
如图2所示，6 种酵母代谢产生的苹果酸、乳酸和琥珀酸含量较高。苹果酸具有特殊的、令人愉悦的酸味，乳酸和琥珀酸可以给酸面团带来柔和、酸甜的味道，且乳酸具有脂样香气，可以令酸面团香味更加丰富。5 株实验室保藏酵母代谢产生的乳酸高出商业酵母L约38%～49%，琥珀酸高出约19%～26%，表明实验室保藏酵母也具有较好的有机酸代谢能力；酵母Y-2代谢产生柠檬酸含量较高，比其他酵母菌高出约71.06%～77.97%，柠檬酸的酸性较强，会导致面团pH值下降，这与表3中酵母Y-2具有较低pH值的结果一致。
2.不同酵母对酸面团感官评价的影响
对6 种酸面团的风味进行感官评价，结果如表4所示。与商业酵母L相比，5 株老面酵母制作的酸面团都具有较好的麦香味，但感官评价得分不具有显著差异。酵母Y-3和Y-4制作的酸面团发酵味得分最高，均为（8.00±1.00）分，显著高于商业酵母L、酵母Y-1和Y-2制作的酸面团（
P＜0.05）。与商业酵母L制作的酸面团相比，酵母Y-3、Y-1、Y-4和Y-5制作的酸面团异味得分没有显著差异，而酵母Y-2制作的酸面团异味得分最低，表明酵母Y-2制作的酸面团异味比较明显。结合表3和图2的结果，这可能与Y-2菌株较高的产酸能力有关，其代谢产生的柠檬酸含量较高。柠檬酸风味较刺激，浓度较高时会略带苦味，对酸面团风味具有不好的影响。
综合以上实验结果，选取实验室保藏酵母Y-3、Y-4，并以商业酵母L为对照制作面包，探究不同酵母对于以酸面团作为发酵剂制作的面包品质和风味的影响。
3.同酵母对面包比容和质构的影响
面包比容和质构特性是评价面包品质的关键因素。面包的比容、弹性、内聚性和恢复力与面包品质呈正相关，硬度、黏附性、黏性和咀嚼性与面包品质呈负相关。比容越大，酵母的发酵能力越强，面包的弹性、内聚性和恢复力越大，面包品质越高，口感越好。
由表5可知，3 种酵母都表现出了较好的发酵能力，其中商业酵母L制作的面包比容最大，但酵母Y-4制作的面包比容与商业酵母L相比差异不显著。
3 种酵母制作的面包的弹性、内聚性和恢复力差异均不显著，其中商业酵母L制作的面包硬度和黏附性最大，达到（431.17±38.33）g和（8.80±4.65）g·s；相较于商业酵母L制作的面包，酵母Y-3制作的酸面团面包硬度降低16.77%，黏附性降低72.39%。上述结果表明，酵母Y-3和Y-4制作的面包不易黏连，较为蓬松柔软。
4.不同酵母对面包感官评价的影响
如表6所示，首先从风味方面来看，3 种面包的酒味评分相差较大，差异显著，其中酵母Y-4制作的面包酒味最浓；除酒味外，酵母Y-4的发酵香味和果香味也较为突出，分值分别为7.74±0.55和3.86±1.34，显著高于商业酵母L和酵母Y-3（
P＜0.05）；商业酵母L制作的面包奶香味较为突出，感官得分比其他面包略高，分值为6.79±1.03；3 种面包的谷物香味和烤香味感官得分接近且不具有显著差异，其中酵母Y-3制作的面包谷物香味分值稍高，表明酵母Y-3制作的面包谷物香味较浓郁。
从滋味来看，3 种面包的回甜和回酸均无显著差异，但相较于商业酵母L，酵母Y-3和酵母Y-4所得分值较高，表明老面酵母对面包滋味具有积极影响；商业酵母L的奶香味分值最高（6.91±1.33），这与它在风味中较高的奶香味结果一致；酵母Y-4制作的面包酒酿味的得分最高，分值为3.61±0.55，这与它在风味中得分较高的酒味（6.57±1.37）结果相呼应，表明酒味及酒酿味可能是酵母Y-4所具有的特殊风味。
5.不同酵母对酸面团和面包风味物质的影响
如表7所示，商业酵母L和实验室保藏酵母Y-3、Y-4制备的酸面团和发酵的面包中共检出75 种风味物质，其中醇类化合物19 种、酯类化合物23 种、醛类化合物12 种、酸类化合物5 种、酮类化合物11 种、其他类5 种。不同酵母制作的酸面团和面包中各类风味物质的相对含量如图3所示。
3 种酵母制作的面包中风味化合物种类比酸面团丰富，主要风味物质是醇类化合物，相对含量达到72%～81%，其次为酯类化合物，但酯类化合物在酸面团中的相对含量更高。相同酵母制作的酸面团和面包，其醇类化合物的相对含量比较接近，以实验室保藏酵母Y-3和Y-4更为明显。与商业酵母L相比，实验室保藏酵母Y-3和Y-4制作的酸面团中酸类物质及面包中的醛类物质相对含量较高。仅通过挥发性风味物质的相对含量无法确认其对样品风味的影响，相对含量高的挥发性成分并不能说明其对样品风味的贡献程度大，还需要结合感官阈值进行OAV分析。
根据酸面团和面包中风味物质的相对浓度和各物质在水溶液中的感官阈值，计算各风味物质的OAV，结果如表7所示。商业酵母L制作的酸面团和面包中OAV＞1的风味化合物共有23 种，分别为醇类6/4 种（酸面团/面包，下同）、酯类4/4 种、醛类2/4 种、酸类0/2 种、酮类0/3 种、其他类0/0 种；酵母Y-3制作的酸面团和面包中OAV＞1的风味化合物共有31 种，分别为醇类8/4 种、酯类6/5 种、醛类3/8 种、酸类4/2 种、酮类0/3 种、其他类1/0 种；酵母Y-4制作的酸面团和面包中OAV＞1的风味化合物共有36 种，分别为醇类9/5 种、酯类6/6 种、醛类1/10 种、酸类2/1 种、酮类0/3 种、其他类2/1 种。
醇类物质是酵母通过糖的分解代谢或脱羧反应，以及氨基酸的脱氨基作用而形成的一类酵母代谢产物，具有芳香、植物香等气味和较高的感官阈值。适宜浓度的醇类物质可以促进香气协调性，是酸面团中一类较为重要的香气物质。3 种酵母制作的酸面团和面包中OAV＞1的共有醇类化合物为异戊醇和苯乙醇，其中异戊醇是酸面团中对风味具有主要贡献的醇类物质，为酸面团提供浓郁的发酵香味。酵母Y-3酸面团中异戊醇OAV为931.57，酵母Y-4酸面团为438.86，而商业酵母L只有145.31，表明酵母Y-3和酵母Y-4酸面团的发酵香味更好，这与酸面团感官评价结果（表4）一致；苯乙醇是面包中起到主要贡献的醇类物质，以商业酵母L酸面团为发酵剂制作的面包，苯乙醇OAV为23 463.19，酵母Y-3酸面团面包为28 912.48，酵母Y-4酸面团面包为25 317.28，赋予了面包香甜的面包香和淡淡的玫瑰花香，其中以酵母Y-3酸面团为发酵剂制作的面包香气最为浓郁。
酯类物质通常在发酵过程中形成，或由低级饱和脂肪酸与醇类物质发生酯化反应而形成，具有令人愉快的水果甜香或酒香，可为酸面团和面包提供特殊风味。3 种酵母制作的酸面团和面包中OAV＞1的共有酯类化合物为丁酸甲酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，这3 种酯类物质对酸面团风味起到主要的贡献作用，赋予酸面团清甜的果香和白兰地酒香。酵母Y-3制作的酸面团中己酸乙酯OAV最高，为141 508.28，而商业酵母L最低，为8 036.94，表明酵母Y-3对酸面团风味能够产生积极影响；面包中主要酯类物质的OAV略低于酸面团，但其仍是对面包风味具有重要贡献的香气物质。
醛类物质是酵母发酵代谢产物，也是面包烘焙过程中美拉德反应的主要产物，具有奶油、水果以及香草等清香的气味，风味阈值较低，且对于香气有贡献的醛类物质一般为高级醛，因此醛类物质是酸面团面包风味的重要组成部分。3 种酵母制作的酸面团和面包中OAV大于1的共有醛类化合物为壬醛，壬醛的产生可能来自于微生物的发酵作用，因此酸面团中壬醛的OAV略高于面包。酵母Y-3制作的酸面团壬醛的OAV最高，为466.81，赋予酸面团令人愉悦的玫瑰和柑橘香气；面包中醛类物质数量远高于酸面团，且均能为面包提供一定的风味，使面包风味更加丰富多样。除壬醛外，对面包风味起到主要贡献作用的醛类物质还有苯甲醛和反式-2-壬烯醛，为面包提供清新的果香，其中以酵母Y-3酸面团为发酵剂制作的面包中苯甲醛和反式-2-壬烯醛的OAV最高，分别达到641.57和693.88，使得酵母Y-3酸面团面包的香气最丰富浓郁。
3 种酸面团和面包中还存在着少量的酸类、酮类和其他类物质，其中酸类物质的形成是酸面团面包具有独特风味的主要原因，对3 种酵母制作的酸面团和面包风味起到主要贡献作用的酸类物质为己酸，赋予酸面团和面包柔和的奶酪香气；酮类物质大部分具有特殊香气，且对面包风味的贡献较为明显，如2-壬酮赋予面包香浓的芝士香味，2-庚酮则为面包提供清淡的椰子香气，使面包风味更加多元化；其他类物质中，OAV较高的为2-甲氧基-4-乙烯苯酚，为酸面团和面包提供清新的花香。
运用Origin Pro 2021软件对3 种酵母制作的酸面团和面包中部分OAV大于1的风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见表8，不同样品风味物质PCA得分图及载荷图见图4。
PCA是一种通过降维将多个变量变为少数综合变量，用简化的数据反映原始变量大部分信息的统计方法，当累计贡献率超过80%时，通常认为两种PC基本包含样品的信息。如表8所示，在3 种酵母制作的酸面团和酸面团面包的风味物质中，共提取出4 个特征值大于1的PC，其中前2 个PC的方差贡献率分别为70.13%和14.42%，累计方差贡献率已经达到84.55%，综合了酸面团和面包中风味物质的大部分信息。
从图4可以看出，3 种酸面团和3 种面包间的区分较好，不同酵母制作的酸面团和面包分别位于不同区域。酵母Y-3、Y-4制作的酸面团均位于两种PC的正半轴，得分较高，酵母Y-3酸面团中具有主要贡献的风味物质为酯类物质，如辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯等，赋予酸面团清甜的果香和淡淡的白兰地酒香；酵母Y-4酸面团中的主要风味物质为醇类物质，如苯乙醇和蘑菇醇等，为酸面团提供了蘑菇肉汤香气和淡淡的玫瑰花香；而商业酵母L制作的酸面团位于PC1正半轴、PC2负半轴，相较于实验室保藏酵母制作的酸面团得分较低，具有主要贡献的风味物质为己酸和椰子醛，使酸面团具有椰子香气和奶油乳香。
以商业酵母L酸面团为发酵剂制作的面包位于两种PC的负半轴，得分较低，风味较差，不具有对风味起到贡献作用的物质；以酵母Y-3、Y-4酸面团为发酵剂制作的面包位于PC1负半轴、PC2正半轴，2 种面包得分较接近，风味强于商业酵母L酸面团面包，主要的风味物质为醛类物质，如正癸醛、正己醛和反式-2-壬烯醛等，为面包提供了浓郁的果香和清新的植物类香气；正戊醇和乙酸甲酯也为2 种面包提供风味，赋予面包酯类甜香和淡淡的酒香，使面包香气更加丰富多样。
结论
不同酵母对糖及有机酸的代谢能力不同，对酸面团及酸面团面包的品质和风味影响不同。以商业酵母L为对照，本研究发现实验室保藏的酵母Y-1、Y-3、Y-4和Y-5都表现出较好的糖代谢能力，能够代谢产生较高的苹果酸、乳酸和琥珀酸。其中酵母Y-3、Y-4和商业酵母L制作的酸面团中共检测出54 种风味物质，OAV＞1的香气物质有27 种，酵母Y-3和Y-4制备的酸面团风味物质更丰富，对酸面团起到主要贡献作用的风味物质为醇类和酯类，还有少量的醛类物质。
酵母Y-3和Y-4酸面团制作的面包内部组织结构蓬松，气孔均匀致密，持气性能好，感官得分最高。以商业酵母L、酵母Y-3和酵母Y-4酸面团为发酵剂制作的面包共检出56 种不同风味化合物，OAV＞1的香气物质有29 种，其中醛类物质最多，其次是酯类、醇类等。酵母Y-3酸面团面包中己酸乙酯的OAV最高（730.38），为面包提供清甜浓郁的果香味和淡淡的白兰地酒香。PCA结果表明，酵母Y-3酸面团制作的面包风味最浓郁，使面包具有丰富多样的果香和奶油甜香。酵母Y-3显著改善了面包的品质和风味，具有较大工业应用潜力。
本文《不同酵母对酸面团发酵剂及面包品质和风味的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第22期257-266页，作者：沈鑫，杨海莺，应欣，赵凯，牛兴和，李慧，吕莹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230115-113。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：渤海大学食品科学与工程学院 王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
大曲作为糖化发酵剂，为白酒酿造提供了重要且丰富的菌系、酶系和物系，即为后续窖内酒醅发酵提供微生物，将原料降解成小分子物质的水解酶或催化酯类物质合成的酯化酶，以及白酒风味物质或其前体物。大曲生产过程通常包括1 个月左右的主发酵期和2～6 个月左右的贮存期。在主发酵期，来自于制曲原料及环境的微生物生长代谢，通过开关门窗、揭盖草帘进行工艺调控，其间，温度、湿度等不断变化，微生物菌群发生演替，同时积累了丰富的酶系以及风味物质。而在贮存期，大曲大多是在自然条件下堆积存放，期间水分、酸度和淀粉的变化相对稳定，初级、次级代谢过程以及各种微生物和代谢物发生复杂变化。目前对大曲质量的判断主要依赖于长期积累的生产经验和部分理化性质，这使得大曲的生产质量充满不稳定性。近年来，关于大曲主发酵期间微生物群落及功能变化机制的研究非常活跃，而贮存期大曲微生物群落结构、酶系以及风味物质变化也越来越受到关注。Fan Guangsen等通过高通量测序技术发现大曲在通风良好、干燥的贮存环境中微生物会进一步相互作用，达到优化微生物群落的效果，同时发现清香型大曲经贮存后酯化力和发酵力增加，而液化力和糖化力变化不大。He Muwen等采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术测定贮存期大曲挥发性代谢产物，发现风味物质种类逐渐积累，在贮存3 个月含量达到最高，而Zhang Yuandi等发现贮存使挥发性化合物的种类和含量有所下降。总之，现有研究显示贮存过程对大曲质量具有重要影响，但关于贮存期大曲微生物群落结构及代谢产物变化机制的研究鲜有报道。
对于微生物群落的演替机制，人们广泛认可随机性过程和确定性过程同时影响菌群的组装过程。Tan Yuwei等采用构建零模型的方法评估了白酒发酵过程中微生物群落的组装模式，结果显示微生物群落的演替既受确定性因素（温度、有机酸和乙醇）的驱动，也受随机性过程的驱动。Xu Min等发现微生物的生态位差异也影响着群落的构建过程。大曲代谢物的变化被发现与微生物群落的演替紧密相关。Gan Shuheng等通过宏基因组测序获得了糖化力、液化力与杆菌纲、曲霉属、罗山松属和散囊菌目间的正相关关系。He Muwen等采用相关性网络分析挥发性化合物与微生物之间的关联，结果显示，曲霉属、根毛霉属、芽孢杆菌属、横梗霉属与酯类的形成呈正相关。
对于固态发酵基质而言，热量、水和氧气难以传递，Zhang Yuandi等发现同一块大曲不同部位的微生物群和挥发性物质具有不同的分布特征，因此大曲曲心和曲皮的微生物生长代谢存在差异。四川轻化工大学生物工程学院的徐千惠，罗惠波，黄丹*等通过高通量测序解析浓香型大曲的曲心和曲皮在贮存期间发生的微生物群落结构变化，并分析糖化酶、液化酶活力的变化，利用HS-SPME-GC-MS研究挥发性代谢产物的差异，构建零模型解析微生物群落的组装过程，运用相关性分析探究糖化力、液化力、风味物质与大曲微生物之间的联系，揭示浓香型大曲贮存期菌系、酶系以及物系的变化机制，为优化大曲贮存工艺、提高大曲质量提供理论依据。
1 浓香型大曲贮存过程中微生物群落结构变化
1.1 浓香型大曲贮存过程中优势微生物群落演替特征大曲微生物在持续进行的贮存过程中此消彼长，采用高通量测序对其演替情况进行解析。
在大曲贮存期间共注释到16 个细菌门和4 个真菌门，212 个细菌属和30 个真菌属，其中将平均相对丰度前10的优势微生物属变化情况绘制成柱形图展示。由图1a可知，曲皮在入库贮存第0天的主要优势细菌是芽孢杆菌属（
Bacillus）（23.69%）、假单胞菌属（
Pseudomonas）（26.58%）、魏斯氏菌属（
Weissella）（20.94%）等，这种优势地位到了贮存第43天被链球菌属（
Streptococcus）（33.31%）、放线菌属（
Actinomyces）（18.83%）取代。贮存第43～108天，魏斯氏菌属迅速生长成为绝对优势细菌（1.41%～63.08%）。贮存第108天和第161天的曲皮细菌组成较为相似，这与唐贤华等得出的贮存期导致大曲微生物种类趋于平稳的研究结论一致。并且有研究结果可以解释这一现象：贮存过程中温度、水分、酸度等环境条件的变化会导致大曲微生物之间进一步相互作用，使群落结构趋于相似，最终形成一种稳定体系。而在曲心，贮存前43 d的细菌组成较为一致，由芽孢杆菌属、克罗彭斯特菌属（
Kroppenstedtia）、高温放线菌属（
Thermoactinomyces）、假单胞菌属、葡萄球菌属（
Staphylococcus）等组成。假单胞菌属的相对丰度最高，呈明显的上升趋势（15.84%～76.70%），而芽孢杆菌属在持续下降（43.24%～9.23%）。葡萄球菌属在贮存前9 d的含量较为丰富（12.73%～10.74%），随后立即让位给其他细菌，在贮存第108～161天的相对丰度保持在0.42%～1.67%。随着贮存时间的延长，除了芽孢杆菌属的相对丰度在10%左右波动外，其余在贮存开始时呈明显优势的细菌都在衰减，而乳杆菌属（
Lactobacillus）、放线菌属、链球菌属、肠球菌属（
Enterococcus）等相对丰度增加，这种变化与Jin Yao等的发现一致。由图1b可知，曲皮和曲心在贮存过程中的真菌皆以嗜热子囊菌属（
Thermoascus）为主，其相对丰度在曲皮和曲心中的变化规律大体一致，均从一个极高的相对丰度（96.89%、93.29%）波动下降。其次是曲霉属（
Aspergillus），在贮存第0天几乎没有，而后大量生长，但不同的是从贮存第9天开始，曲霉在曲心中总体呈波动上升趋势（22.17%～30.35%），而在曲皮中呈快速下降趋势（60.82%～2.41%）。毕赤酵母属（
Pichia）在曲心中的相对丰度很低（0%～0.96%），但在曲皮中却大量生长，是曲皮在贮存第108天的绝对优势真菌（68.89%）。
总体看来，大曲贮存过程使曲皮中的魏斯氏菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属和曲心中的高温放线菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、曲霉属的相对丰度得到了极大提高，同时使曲皮和曲心中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜热子囊菌属等的相对丰度下降。此外，曲皮中others的变化情况显示了大曲中一些原本的极低丰度微生物可能由于适应曲库的环境条件以及微生物之间友好的相互关系而大量生长，同时一些微生物因为适应性差而走向衰竭。这些结果都表明贮存使大曲微生物间相互作用重新平衡，改变了微生物群落组成。
1.2 浓香型大曲贮存过程中菌群结构特征的变化
不同贮存时间的大曲微生物
多样性指数如图2所示。Chao1指数反映物种的丰富度，大曲贮存前43 d的微生物丰富度相差不大，随着贮存时间的延长，曲心中细菌的Chao1指数在贮存第108天增长至最大，而真菌的Chao1指数在第43天达到最高值后减小。总体看来，贮存过程使大曲微生物的丰富度略有降低。Pielou’s evenness指数表征均匀度，在大曲贮存期间，微生物群落的均匀度呈现先增加再减少的趋势。贮存第161天的细菌群落均表现出稍稍低于贮存第0天的均匀度，而真菌群落的均匀度总体增加，表明贮存过程塑造了更为均匀的真菌群落。Shannon指数反映物种多样性，大曲的物种多样性与均匀度的变化趋势较为相似，总体上贮存过程增加了大曲的微生物多样性。
为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化，对大曲样品进行PCoA。由图3a可知，PC1和PC2对细菌群落组成差异的解释度分别为29.63%和22.15%，共计51.78%。贮存前43 d的曲心细菌结构相近，但曲皮细菌样本相互分离较远，说明贮存前43 d内曲皮细菌结构发生了明显变化。贮存第108、161天曲心和曲皮的细菌样本各自聚在一起，表明大曲贮存3 个月后，细菌结构已经趋于稳定，这与以往的研究一致。如图3b所示，PC1和PC2对真菌群落组成差异的解释度分别为53.02%和41.79%，总解释度高达94.81%。曲心的真菌结构总体距离相近，说明曲心真菌结构在贮存过程中变化不大，并且与贮存第0、43、161天的曲皮真菌结构相似性较高，但分别与曲皮在第9、108天的真菌结构相差甚远。为进一步了解大曲贮存期间微生物群落结构，Venn图展示了不同贮存时期间的共有微生物及特有微生物数量。如图4所示，在属水平上，曲皮、曲心在5 个贮存时期分别有13、14 个共有物种，其中绝大部分如曲霉属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属、魏斯氏菌属等都属于图1中的优势菌属，但它们在贮存不同时期的相对丰度各不相同。曲皮和曲心在每个贮存时期的特有物种数量总和分别占53%和50%，表明大曲贮存过程中的微生物差异由一半的共有物种的丰度差异和一半的特有物种的物种差异组成。这些结果同样表明一些原本的极低丰度微生物可能会随着贮存的进行大量生长，同时一些微生物丰度降至极低，也有研究显示部分特有低丰度微生物来自贮存环境。
2 浓香型大曲贮存过程中糖化力和液化力的变化
糖化酶是微生物代谢产生的重要酶类，能将酿酒原料中的淀粉、纤维素等多糖降解为还原糖，再由酵母等微生物进一步转化为乙醇，因此糖化力是大曲重要的生化指标。由图5a可知，曲皮糖化力在贮存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在贮存第108～161天内大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之间呈现比较规律的波动。液化酶能断裂淀粉分子的
-1,4-糖苷键生成糊精等中间产物。图5b所示的曲皮液化力在贮存第0～43天内略有降低（0.37～0.12 g/（g·h）），从贮存第43天开始持续增加至贮存结束（0.12～0.30 g/（g·h））。曲心液化力在贮存前43 d内维持在0.08 g/（g·h），之后快速上升并稳定在0.27～0.21 g/（g·h）。总体看来，与以往的研究一致，糖化力和液化力在贮存约43 d内呈下降趋势，随后整体回升。曲皮的糖化力和液化力均在贮存后略微降低，而曲心中的二者在贮存后升高。有研究表明，大曲在贮存初期具有较高的液化和糖化活性，且二者往往呈正相关，后来酶活性降低，转变为较高的酯化活性，这与贮存后期酯类物质含量快速增加有关。
3 浓香型大曲贮存过程中挥发性代谢产物的变化
大曲中的风味物质可以作为酒体中香气物质的直接来源，也可作为酒中香气物质的重要前驱物来源。采用HS-SPME-GC-MS分别在贮存过程的曲心和曲皮位置检测到67、70 种挥发性化合物，可分为醇类、酯类、酚类、酸类、醛酮类、烷烯类、吡嗪类和其他物质。由图6可知，曲皮中风味物质的总含量随着贮存时间呈现先下降后上升再下降的变化趋势，其中在贮存约3 个月时总含量达到最高，这在其他报道中也有同样的发现，相比之下，曲心中的风味物质含量总体较为稳定，仅在贮存结束时发生了较大的下降。酯类物质是中国白酒中令人愉悦的水果、花香、蜂蜜香气的主要贡献者，是贮存期间占比最大的挥发性风味物质，令人注意的是其在曲皮贮存第108天时发生了激增，与前述微生物群落演替结果相结合，推测这种变化可能与魏斯氏菌和毕赤酵母的剧烈增加有关。据报道，魏斯氏菌发酵产生乳酸，为乳酸乙酯的合成提供前体物质，毕赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化过程中发挥重要作用。醇作为酸和酯的重要前体物质，其含量仅次于酯类，在贮存期间变化幅度不大。酸类、烷烯类、醛酮类物质的变化比较一致，表现为贮存初期有较高的含量，之后迅速下降，并在之后的贮存期间保持非常低的含量。总体上，贮存过程使风味物质总含量减少，这与Zhang Yuandi等的研究结果一致。其中醇类物质、酯类物质略微降低，酸类物质、烷烯类物质、醛酮类物质大量减少。结果表明随着贮存时间的推移，一些重要的风味化合物被丰富，一些异杂味被减少或去除，同时伴随着部分风味物质的挥发，说明贮存过程有助于“净化”风味、形成独特浓郁的“大曲味”。
4 浓香型大曲贮存过程中微生物群落的演替机制
为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化原因，采用系统发育零模型计算大曲微生物群落的βNTI来判断群落的构建过程。如图7a所示，曲皮细菌群落的βNTI值在－1.12～5.05之间变化，曲心细菌在－1.28～5.55之间变化，二者的|βNTI|＞2的占比均为40%，说明细菌群落的组装过程主要受60%的随机性过程影响，同时受40%的确定性过程影响。曲皮真菌群落的βNTI值在－0.64～3.61之间波动，其|βNTI|＞2的比例为20%，说明曲皮真菌群落受随机性过程主导（80%）。而曲心真菌仅在－1.52～1.76之间波动，说明其完全受随机性过程影响（100%）。总体上，大曲贮存期间微生物群落的组装主要由随机性过程主导。相较于真菌来说，细菌受确定性过程的影响更大；相较于曲心微生物来说，曲皮微生物受确定性过程的影响更大。
为了进一步量化随机性和确定性过程在贮存期大曲微生物群落构建中的贡献程度，图7b显示了群落的修正RCbray。结果表明无论是曲皮还是曲心，对细菌群落构建的影响因素包括40%的变量选择（环境因子、微生物相互作用等）、40%的扩散限制以及20%的未定义过程（生态漂变等）。而真菌群落则大部分受未定义过程的影响（曲皮70%、曲心90%），说明主要由生态漂变等导致真菌结构发生随机变化。变量选择对曲皮真菌群落构建的贡献为30%，但对曲心真菌的贡献为0。匀质扩散只在曲心真菌群落构建过程中发挥了一定作用（10%），这种生态过程会导致群落结构的相似性。而对于细菌群落来说，相对稳定的贮存环境可能导致扩散限制较大地影响了细菌在曲库中的扩散。有研究表明，真菌群落在曲心中倾向于随机分散，而细菌群落则偏好聚集状态。结果表明，变量选择对微生物菌群（尤其是曲皮中）发挥较大的作用，说明贮存条件的改变及微生物间的相互作用对群落演替十分重要。而目前的生产中，贮存期间几乎都未采取人工调控温湿度等措施，使气候条件成了重要因素，可见在大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量具有重要意义。
大曲贮存过程中微生物的生态位宽度如图8所示。曲心细菌和曲皮真菌在贮存第108天和曲皮细菌在贮存第43天时的生态位宽度发生激增，说明这时候微生物对环境资源的利用程度大大增加，这一时期的变化与图1中优势菌群结构发生剧烈演替相符合。对比贮存前后的生态位宽度，结果显示除了曲皮细菌外，其余菌群的生态位宽度经贮存后都增加，说明贮存使大曲微生物对环境资源的利用增加，对微生物间相互作用的适应状况更好。贮存过程中不同时期的大曲微生物占据着不同的生态位，显示了对环境扰动的不同响应，这种响应是由其生理耐受性、扩散能力、分类多样性和功能多样性等共同介导，因此贮存期大曲微生物群落不同的组装过程可能是受到微生物群对环境干扰的不同响应和生态位宽度的差异所影响。此结果与零模型的分析结果一致反映了贮存环境对大曲微生物生长代谢的重要性。
5 浓香型大曲贮存过程中重要酶活力与微生物群落演替的相关性
贮存期间大曲微生物群落不断变化，并通过代谢活动引起酶活力的变化。通过RDA探究两种重要酶活力与大曲微生物间的关联，其中RDA1和RDA2（加权）标准正交物种得分大于0.09的菌属见图9。如图9a所示，曲皮中，糖化力与嗜热子囊菌属呈负相关，与毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属和曲霉属呈正相关。贮存第108天和第161天的曲皮样本与液化力极为相关，其中属毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属贡献最大。由图9b可知，曲心中的糖化力和液化力均与科萨克氏菌属（
Kosakonia）呈负相关，与嗜热子囊菌属、曲霉属呈强正相关，相比之下，与嗜热真菌属（
Thermomyces）、高温放线菌属的正相关性较弱。结果显示，毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属等微生物通过代谢作用有助于提高糖化酶、液化酶活力。一些研究报道了嗜热子囊菌属、曲霉、根毛霉属及芽孢杆菌属等大曲核心微生物具有强大的水解能力，有助于淀粉的液化和糖化，为后续风味化合物的形成打下基础。
6 浓香型大曲贮存过程中挥发性风味物质与微生物群落演替的相关性
为探究大曲贮存期间挥发性风味物质的变化机制，利用Spearman相关性分析评估挥发性化合物与微生物的关联。如图10a所示，曲皮中一些酯类物质如9-十六碳烯酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、十八烯酸乙酯与根霉属（
Rhizopus）、威克汉姆酵母属（
Wickerhamomyces）等呈显著负相关。乙酸乙酯与黄杆菌属（
Flavobacterium）、假单胞菌属呈显著正相关，与放线菌属、链格孢属（
Alternaria）、棒状杆菌属（
Corynebacterium）、梭杆菌属（
Fusobacterium）等呈显著负相关。并且苯乙醇也和这些菌属呈显著负相关，而与假单胞菌属、克罗彭斯特菌属呈显著正相关。乙醇、正戊醇、2,3-丁二醇聚为一类，与醋杆菌属（
Acetobacter）、链霉菌属（
Streptomyces）呈极显著正相关。有研究显示，大曲中的苯乙醇、戊醇等高级醇可能是通过Ehrlich代谢途径的氨基酸分解代谢形成，也可能是由一些微生物菌株的脂质氧化形成。在曲皮中仅检测到2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪两种吡嗪物质，均与假单胞菌属、克罗彭斯特菌属呈显著正相关。如图10b所示，在曲心中检测到了更多吡嗪种类，其中2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪与魏斯氏菌属、乳杆菌属、肠球菌属呈显著负相关，与芽孢杆菌属、嗜热子囊菌属呈显著正相关；而2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪则与微小杆菌属（
Exiguobacterium）、短状杆菌属（
Brachybacterium）、热杆菌属（
Thermobacillus）呈极显著正相关，这与以往的研究一致，因此通过调节这些微生物的丰度和活性有助于白酒中作为健康因子的吡嗪含量的提升。据报道，芽孢杆菌通过分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等将淀粉和蛋白质转化为葡萄糖和氨基酸，从而产生挥发性化合物及其前体物质，如吡嗪、芳香族化合物、酚类化合物和有机酸，可见芽孢杆菌对大曲的风味和质量有着重要贡献。曲心中辛酸乙酯、癸酸乙酯、十七酸乙酯等与根霉属、克雷伯菌属（
Klebsiella）呈显著正相关，与威克汉姆酵母属呈显著负相关。正己酸乙酯与魏斯氏菌属、肠球菌属、乳杆菌属以及一些非优势菌如栖热菌属（
Thermus）、克洛氏菌属（
Crossiella）等呈显著正相关。总之，大曲贮存过程中挥发性风味物质在很大程度上受到微生物结构及其代谢活性复杂变化的影响，是风味物质挥发和微生物转化共同作用的结果，此结果为后续考虑通过物种强化提高大曲风味质量提供一定的理论基础。
结论
本研究利用高通量测序探究浓香型大曲贮存过程中的微生物群落组成及结构特征。结果显示大曲的贮存过程是微生物进一步相互作用并重新平衡群落结构的过程，长时间的贮存改变了功能微生物比例，最终导致微生物多样性增加、群落结构趋于稳定、均匀。贮存结束后，成熟大曲的曲心微生物群落主要由芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、高温放线菌属、克罗彭斯特菌属、乳杆菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属等组成；曲皮微生物主要包括魏斯氏菌属、乳杆菌、高温放线菌属、嗜热子囊菌属、毕赤酵母属等优势微生物。此外研究了糖化力、液化力以及挥发性风味物质的变化规律，发现贮存过程使曲皮中糖化力、液化力有所下降，但在曲心中有所增加，同时有助于风味物质的丰富和转化，这些变化使曲香更加浓郁。通过构建零模型探索微生物群落的组装机制，发现随机性过程主导了群落结构的变化，同时确定性过程也有重要影响，其中变量选择发挥了较大的作用，生态位差异也有一定影响，这一结论还需更多的研究验证。多元统计分析显示微生物区系与大曲糖化力、液化力及挥发性代谢产物之间有显著相关性，说明贮存有助于通过改变微生物群落生产出高质量大曲。
总之，贮存过程对大曲微生物群落结构的重新平衡、酶活力及挥发性代谢产物的积累与转化具有重要意义，这与Fan Guangsen等的研究结果一致。引起这些变化的确定性过程是变量选择，说明大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量非常重要。此外，还应对微生物的代谢通路进行分析，进一步完善贮存期间大曲品质的变化机制。本研究对优化大曲的贮存工艺、提高大曲品质具有重要意义。
本文《 浓香型大曲贮存期微生物群落演替及代谢产物的变化机制》来源于《食品科学》2023年44卷第22期225-234页，作者徐千惠，饶家权，邹永芳，张 明，罗惠波，黄 丹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230228-257 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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