单细胞ATAC-seq技术（scATAC-seq）被广泛应用于研究基因表达的调控，包括发掘潜在启动子和增强子（promoters and enhancers），比较转录因子（Transcription factor enrichment）富集等。然而，单细胞ATAC-seq数据的分析流程存在诸多不一致。不一致的数据处理会导致下游结果的不一致，而且用不同分析方式产生的数据没有办法放在一起分析。
近日，来自美国宾夕法尼亚大学的Junhyong Kim实验室（第一作者为苗振）在Nature Methods上发表了研究论文Uniform quantification of single-nucleus ATAC-seq data with Paired-Insertion Counting (PIC) and a model-based insertion rate estimator，提出了统一量化scATAC-seq数据的新方法—PIC，以及一个可以精确估计染色质可及性的统计方法。
目前的scATAC-seq数据处理方法中，一个重要的分歧是对于染色质开放区域（open chromatin regions）的定量。scATAC-seq的原始数据是DNA片段（fragments），这些片段来自于两个临近的Tn5转座（如图1a）。
图1a，Tn5 转座位置和测序结果的关系示意图。
为了将这些DNA片段转化为特征矩阵的形式方便下游分析，一部分方法，比如Seurat/Signac和snapATAC会计算每个区域的片段数量（fragment counts），但另一部分方法，比如ArchR和10X Genomics Cell Ranger会计算每个区域的转座数量（Tn5 insertion counts）。这两种方法的结果很不一致。
在特征计数之后，大多数方法将计数转换为“开放”或“关闭”的二进制状态，而其他方法保留定量计数信息。这又出现了新的不一致。所以，这篇文章想要解决这些不一致的问题。
为了理解这些不一致，我们需要了解ATAC-seq中片段（fragment）形成的过程。在标准的ATAC-seq实验中，需要两端分别有Tn5转座，同时转座产生两个不同的扩增引物（primer）才能形成一个扩增片段，因此，一个片段通常对应两个转座事件。这也是为什么在基于转座的计数中，偶数居多。只有当片段跨越一个peak的边界时，才会有奇数出现。而基于片段数量的计数中，数字越大，频率越低。另一方面，基于片段数量的计数方式也存在问题，因为当片段两端都超出peak的区域时，我们没有足够的证据说明这个peak区域是开放的。
文章的第一个任务是确定在scATAC-seq数据中，是否含有定量的信息，以及这些信息有没有生物学意义。通过分析多个生物学数据，文章的两个重要发现包括，1. 某个细胞中特定peak里片段的数量和细胞所属的细胞类型有关。当某个细胞类型中，一个启动子或增强子很活跃时，会有更高的概率在一个细胞里观察到更多的片段。2. 在基因的转录起始位点（TSS），片段数量和基因表达的程度呈高度正相关。以上观察在基于转座的计数方式上并不成立。因此，我们得出：scATAC-seq数据中的确存在定量信息，这些信息对于推断细胞的状态有重要帮助；同时，基于转座数量的计数方式并不能精确得提供定量信息。
该文章提出了一种对单细胞ATAC-seq数据进行定量计数的新方法，PIC (paired insertion count)，作为一种一致性的计数方法，R包的链接在（https://github.com/Zhen-Miao/PICsnATAC）。
此外，文章还提出了一种统计方法用于定量地根据实际数据来估计某一DNA片段的转座效率，以及比较不同细胞类型中转座效率的差别。
总之，这项工作首次确定了，即使scATAC-seq数据非常稀疏（矩阵中>95%的元素都是0），我们仍然能够从数据中得到定量的生物学信息。另外该工作还开发了一个R包，用于一致性地对scATAC-seq数据进行定量和比较。
https://www.nature.com/articles/s41592-023-02103-7
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