2022年5月20日，Nature Plants（IF:15.793）在线发表了题为Boosting plant genome editing with a versatile CRISPR-Combo system的研究论文，该论文由马里兰大学戚益平团队及其合作者共同完成。他们开发了一个多功能的CRISPR-Combo平台，基于单一的Cas9蛋白，用于同时进行植物的基因组编辑（定向诱变或碱基编辑）和基因激活。CRISPR-Combo可以被用来缩短植物的生命周期，通过激活拟南芥中的早花基因来提高筛选T-DNA free株系的效率；可以通过激活杨树的形态基因来加速基因组编辑植物的再生和繁殖；应用CRISPR-Combo在没有外源植物激素的情况下实现了水稻的再生。
虽然基于CRISPR/Cas9系统已经开发出碱基编辑系统、融合的碱基编辑系统、应用在哺乳动物中的可以同时实现基因编辑和基因表达调控的系统以及在哺乳动物中同时实现基因敲除和基因激活的系统，但是，同时实现碱基编辑以及基因激活的系统还没有被开发出来。本文作者打算通过改造他们之前开发的CRISPR-Act3.0系统来实现同时的碱基编辑以及基因激活，CRISPR-Act3.0系统用改造后的sgRNA来招募激活因子，而不是通过Cas9蛋白融合相应的激活因子，因此，在共转条件下共用同一类型的Cas9，利用不同类型的sgRNA靶向不同位点进而实现同时的定向诱变和基因激活，这在理论上是可行的。他们将新系统称之为CRISPR-Combo(CRISPR-Combination)。
首先，他们确认了sgRNA1.0和sgRNA2.0的功能，其中sgRNA1.0具有正常长度的原间隔序列（20nt）；sgRNA2.0具有截短的原间隔序列（15nt），且骨架经过改造，可以招募激活因子，sgRNA2.0与Cas9形成的复合体会导致Cas9不能切割DNA链，但是不影响复合体结合靶位点的功能。实验结果显示，在NGG-PAM条件下，无论是dCas9-Act3.0还是Cas9-Act3.0均可以同时实现基因激活与基因诱变（图1-c,d）。测序结果显示，在水稻和番茄的原生质体检测中带有15nt sgRNA的Cas9-Act3.0没有在OsBBM1和SFT的启动子区域产生可检测的基因组编辑事件，这证实了CRISPR-Combo系统的正交功能。
图1 开发Cas9-Act3.0系统，用于同时进行定向诱变和基因激活
CRISPR-Combo可用于同时碱基编辑和基因激活。该系统可以实现与那些单独含有激活sgRNAs的系统类似的基因激活水平，CBE-Cas9n-Act3.0和ABE-Cas9n-Act3.0系统的碱基编辑活性与传统的CBE-Cas9n和ABE-Cas9n系统相似（图2-c,d）。此外，该系统可以与SpRY相结合，CBE-SpRYn-Act3.0和ABE-SpRYn-Act3.0系统都产生了与典型CBE和ABE可比的碱基编辑效率和碱基编辑窗口。
图2 开发CBe-Cas9n-Act3.0和ABe-Cas9n-Act3.0系统用于同时进行碱基编辑和基因激活
CRISPR-Combo系统加快了培育筛选不含转基因的基因组编辑植物。他们在拟南芥中进行了实验，在诱变基因的同时激活早花基因AtFT，激活后的AtFT可以造成早花表型，而易于筛选基因编辑后的株系（图3-a）。实验结果表明，具有早花表型的株系同样具有高效率的诱变编辑，利用早花表型去筛选突变体，在T2代可以更快速地拿到T-DNA free的株系，加快育种进程（图3-d,e,f）。在对T3株系的验证中，突变基因型和突变表型都如预期（图3-g,h）。以上结果说明他们开发了一个高度特异的基于CRISPR-Combo的编辑平台，用于快速生成T-DNA free的基因编辑植物。
图3 CRISPR-Combo系统通过促进开花实现了无转基因基因编辑植物的快速育种
基于同样的策略，他们在杨树中诱变基因的同时进行形态基因-WUSCHEL (PtWUS）的异位表达，促进了基因组编辑杨树的加速再生；诱变基因的同时激活形态基因在水稻中也适用，诱变OsGW2和OsGN1a基因的同时激活水稻形态基因OsBBM1，基于NGS的基因型分析显示，OsBBM1的激活导致的可遗传突变（同源、双源和异源）大约是OsGW2靶位点非激活构建的两倍；此外，他们发现激活OsBBM1可以实现水稻在无外源激素条件下正常再生。
CRISPR-Combo有可能在基因组和转录组水平上实现组合筛选，为剖析植物的基因型和表型之间的关系开辟了另一条途径。毫无疑问，CRISPR-Combo平台将在植物基因组工程、代谢工程和合成生物学方面开辟新的领域。