天津科技大学生物工程学院安俊侠、王倩倩、范晓光*等以生长周期较短、遗传背景清晰的野生型大肠杆菌（
Escherichia coli）W3110作为出发菌株，设计模块化代谢改造策略。研究通过基因组编辑和组成型质粒表达方式，构建1 株遗传背景清晰、无营养缺陷、无需诱导的大肠杆菌基因工程菌，以期实现NAM为前体发酵生产-NMN。
1 减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗
NAM 是
-NMN 合成的重要前体，大肠杆菌中pncA编码的烟酰胺酶可以催化NAM脱酰胺生成烟酸，是NAM 的主要支路代谢 。因此，首先敲除
pncA基因，减少底盘细胞对NAM的额外消耗，构建出工程菌N-1。目标产物-NMN作为NAD ＋ 的直接前体物，在大肠杆菌中的代谢较为活跃，因此需要对其支路代谢途径进行改造。-NMN的支路代谢主要分为3 种（表3），一是通过
pncC编码的烟酰胺核苷酸酰胺水解酶转化为NaMN ；二是通过
nadR编码的烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶转化为NAD ＋ ；三是通过一系列的核苷酸酶降解为NR。根据文献报道，与-NMN降解相关核苷酸酶基因包括
ushA
aphA
nagD
yjjG
surE等。
在工程菌N-1的基础上，对
-NMN支路代谢途径中的酶进行逐一敲除，获得工程菌N-2～N-8。将上述菌株放到含有0.5 g/L-NMN的摇瓶发酵培养基中培养16 h，考察改造后细胞对产物的消耗情况，结果如图3所示。敲除pncC
nadR基因并不会减少细胞对-NMN的降解，说明-NMN向NaMN和NAD ＋ 的支路代谢并不活跃。敲除
ushA后，底盘细胞对-NMN的消耗量从100%显著降低至25.16%，说明大肠杆菌内-NMN向NR的转化是-NMN的主要支路代谢。继续敲除其他核苷酸酶基因
aphA
nagD
yjjG
surE后，底盘细胞对-NMN的消耗量持续降低。最终，工程菌N-8对产物-NMN的消耗量仅为4.57%，生物量与N-1相比下降了8.84%。通过上述一系列的基因改造，获得了能够用于-NMN积累的优良底盘。
2 构建β-NMN的合成代谢途径
在细胞中实现
-NMN的发酵生产，需要考虑3 个方面的问题，一是前体NAM和产物-NMN的转运；二是前体PRPP的供应；三是催化-NMN合成关键酶Nampt的活力。Shoji等发现Burkholderia cenocepacia来源的烟酸转运蛋白（
BcNiaP）以及
Bacillus mycoides来源的NR转运蛋白（
BmPnuC）可以分别提高大肠杆菌对NAM的摄取和-NMN的外排。
BcNiaP和
BmPnuC均为膜蛋白，表达过强将会影响菌体生长，因此将
niap
Bc
pnuC
Bm基因整合至工程菌N-8基因组
ilvG
ygaY位点上，并使用组成型P
trc启动子控制其表达，获得工程菌N-9和N-10。
PRPP是
-NMN合成的重要前体，主要是由Prs催化ATP上的焦磷酸基转移到5-磷酸核糖的1-羟基位而产生。 为了强化大肠杆菌中PRPP的合成代谢，首先将内源的prsA基因整合至工程菌N-10基因组
gapC位点上，并使用其内源P
prs启动子控制其表达，获得工程菌N-11。 调节基因
purR对大肠杆菌嘌呤生物合成途径所有结构基因的表达起着负调控作用。 因此此研究敲除工程菌N-11的
purR基因以促进
prsA基因的表达，获得工程菌N-12。
在上述代谢改造的基础上，将使用组成型质粒（1.3.1节）表达
Chitinphaga pinensis来源的Nampt，保证关键酶的拷贝数。将重组质粒
QI-pTrc99a- namptCp分别转化至N-9～N-12菌株，获得工程菌N-9’～N-12’，并对其进行摇瓶发酵测试。发酵过程中添加0.5 g/L前体NAM，发酵周期24 h，结果如图4所示。引入
BcNiaP菌株N-9’的发酵液中只检测到0.01 g/L的-NMN，而引入
BmPnuC后，菌株N-10’能够产生0.16 g/L的-NMN，说明大肠杆菌自身并不存在-NMN外排系统，必须依赖外源转运蛋白
BmPnuC才能实现产物的胞外积累。强化
prs基因表达以及敲除
purR基因能够使-NMN的产量提高1.1 倍（0.34 g/L），说明上述基因改造能够有效提高PRPP供应，为-NMN合成提供更充足的前体。但是，
prs基因过表达会导致生物量下降7.8%。
3 筛选高活性的Nampt
Nampt是
-NMN合成的限速酶，筛选高活性的Nampt是提升-NMN发酵产量的关键。根据文献报道，挑选5 个能够在大肠杆菌中表达的Nampt，分别来自于Chitinphaga pinensis、Comamonadaceae bacterium、
Meiothermus ruber
Haemophilus ducreyi
Vibriobacteriophage KVP40 。将不同来源的
nampt基因分别与组成型质粒（1.3.1节）
QI-pTrc99a连接，构建出重组质粒转化至N-12菌株，获得工程菌N-12′～N-16，并对其进行摇瓶发酵测试。发酵过程中添加0.5 g/L前体 NAM，发酵周期24 h，结果如图5所示。引入
VpNampt菌株N-16的-NMN产量最高（0.90 g/L），但生物量最低，这可能与该酶是噬菌体来源有关。与之相比，引入CbNampt菌株N-13的-NMN产量达到0.88 g/L，但生物量与N-16相比提高了1.3 倍。 研究进一步证实，Comamonadaceae bacterium来源的Nampt在大肠杆菌中的作用效果最好，能够在保证细胞生长的同时提升-NMN的发酵产量。
4 加强PRPP供应及产物外排对β-NMN的影响
根据化学计量方程，在摇瓶发酵中添加0.5 g/L前体NAM，理论上能够获得1.37 g/L的
-NMN。但N-13菌株摇瓶发酵只产生了0.88 g/L的-NMN，为理论转化率的64.2%。菌株N-13中关键酶Nampt是以质粒形式表达的，而Prs和BmPnuC是以基因组整合方式表达，因此推测可能是前体PRPP供应或产物外排不足限制了-NMN的合成。在质粒Z-2的基础上，构建了
nampt
Cb
prsA双基因串联质粒Z-6，以及
nampt
Cb
-prsA-pnuC
Bm三基因串联质粒Z-7，并将其分别转化至N-12菌株，获得工程菌N-17和N-18。对上述菌株进行摇瓶发酵测试，发酵过程中添加0.5 g/L前体 NAM，发酵周期24 h，结果如图6所示。强化
prsA基因表达后，菌株N-17的-NMN产量比N-13提高了44.3%（1.27 g/L），但生物量下降了55.1%。强化
pnuC
Bm基因表达后，菌株N-18的-NMN产量进一步提高，达到1.36 g/L，接近理论转化率，但生物量比N-13下降了48.7%。发酵结果表明，加强PRPP供应及产物外排能够有效提高-NMN的发酵产量，但相关基因的表达强度需要严格控制，减少其对细胞生长的负面影响。
5 工程菌N-18分批补料发酵生产β-NMN
为了测试菌株N-18的发酵性能，在5 L发酵罐中进行分批补料发酵实验。发酵过程中添加5 g/L前体NAM，结果如图7所示。4～26 h，随着菌体生长，
-NMN产量不断增加，并保持较高的合成速率。当菌体生长进入稳定期后，随着发酵时间延长，菌体的摄糖速率变慢，-NMN的合成速率有所降低。发酵36 h，-NMN产量达到10.2 g/L，NAM到-NMN的摩尔转化率为74.5%。此外，发酵液中存在1.2 g/L的副产物烟酸，说明除了PncA以外，大肠杆菌内可能存在未知的烟酰胺酶。目前，已有一些发酵法生产
-NMN的报道，发酵方式主要为全细胞催化或者流加NAM发酵，但都需要在产酶或者发酵阶段添加诱导剂（表4）。对比了不同来源的Nampt，发现细菌来源的CbNampt效果与VpNampt相差不大，且对菌体的生长负担较小。在5 L发酵罐补料发酵过程中，无需添加诱导剂即可实现-NMN发酵生产，菌体生物量较高。但是，由于副产物烟酸的产生，限制了底物向-NMN的转化。值得注意的是，在摇瓶发酵中并没有检测到烟酸积累，烟酰胺几乎完全转化为-NMN。但在分批补料发酵过程中，当菌体浓度较高时，烟酸开始形成，-NMN生产速率显著下降。根据上述现象，后续可以从代谢工程和发酵工程角度提升工程菌的发酵水平：一是通过启动子和RBS序列优化Nampt、Prs和
BmPnuC的表达水平，并利用生物信息学筛选未知的烟酰胺酶；二是调整底物流加方式和流加时间，防止过量补加NAM；三是调整补糖速率和溶氧水平，防止菌体的过度生长，减少副产物的产生。
结 论
研究以野生型大肠杆菌为底盘细胞，通过系统代谢工程改造，实现了
-NMN的发酵生产。主要策略包括：1）对NAM和-NMN的支路代谢涉及的8 个酶进行失活，减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗；2）引入外源NAM和-NMN的转运蛋白以及Nampt，增强胞内PRPP供给，实现了-NMN的初步积累（0.34 g/L）；3）比较筛选了酶活力较高且对底盘细胞生长负担较小的Nampt，通过进一步优化PRPP供应和产物外排，-NMN的摇瓶发酵产量提高至1.36 g/L。工程菌N-18于5 L发酵罐中发酵38 h，-NMN产量可达10.2 g/L，NAM到-NMN的摩尔转化率为74.5%。研究构建的-NMN发酵菌株具有遗传背景清晰、无营养缺陷、无需诱导等优势，可为-NMN的工业化发酵生产及菌株改良提供理论依据。本文《代谢工程改造大肠杆菌发酵生产β-烟酰胺单核苷酸》来源于《食品科学》2023年44卷第22期158-164页，作者：安俊侠，王倩倩，王昭颖，刘 欢，徐庆阳，范晓光。DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20230301-002.点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；北京林业大学生物科学与技术学院 栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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