噬菌体是一类专门裂解细菌的病毒，在自然界中种类繁多，分布广泛，是生物界最丰富的物种之一。在早期研究中人们发现噬菌体对细菌具有特异性的高效灭杀作用。如今多重耐药细菌已经成为食品领域不可忽视的问题之一，噬菌体作为新型抑菌剂已被批准应用于食品及原料和相关环境中，但天然噬菌体狭窄的宿主谱及耐噬菌体细菌的产生限制了噬菌体抑菌剂的发展。近年来随着分子生物学的快速发展，通过人工改造获得宽谱噬菌体的方法已经取得突破性进展，噬菌体作为未来新型抗菌剂在食品领域具有不可估量的潜力。
鉴于此，渤海大学食品科学与工程学院的李凡、于振兴、张德福*等人对噬菌体受体结合蛋白及其宿主谱扩展的相关研究进行综述，旨在为食品工业领域提供相应参考。
1
噬菌体受体结合蛋白
目前世界上报道最多并已在食品及医疗等领域投入使用的噬菌体主要是有尾噬菌体目的双链DNA噬菌体，其主要宿主为细菌与古细菌。有尾噬菌体由二十面体的头部、尾部与固定细胞器组成，根据其尾部的长短及伸缩性可分为短尾噬菌体、长尾噬菌体与肌尾噬菌体。有尾噬菌体在感染过程中通常利用尾部对宿主细胞进行吸附并将自身蛋白质与遗传物质注入细菌。
有尾噬菌体对宿主菌的感染依赖于尾部的特异性识别功能，过程中起关键作用的结构为附着在噬菌体尾部末端的受体结合蛋白，受体结合蛋白可以与宿主菌细胞表面蛋白质、多糖等特定配体相互作用，帮助噬菌体进行宿主识别、不可逆附着和基因组释放。根据形态结构的不同，受体结合蛋白主要可分为尾丝蛋白（TFPs）和尾刺蛋白（TSPs）两类。TFPs是一种细长的纤维状蛋白，一般不具有酶活性；TSPs长度较短但数量众多，通常对宿主菌表面的多糖等特定结构具有酶活性。一种噬菌体可同明包含多种受体结合蛋白，不同受体结合蛋白的作用对象差异较大，常见结构有细菌表面的外膜蛋白、脂多糖、磷壁酸、荚膜多糖，甚至一些细胞器如鞭毛或纤毛等也可以成为受体结合蛋白的作用对象。
作为噬菌体与宿主菌的第一个接触位点，噬菌体的受体结合蛋白是决定其宿主范围的关键因素之一，也是噬菌体与细菌互作机制及噬菌体宿主谱扩展的研究重点。随着X射线晶体学、低温电子显微镜成像等新型技术快速发展并已经广泛运用到分子结构相关研究中，通过与传统的生理生化研究法相结合，人们已经解析构建出多种噬菌体尾部结构的模型，并揭示了许多噬菌体受体结合蛋白的原子结构。
1.1 尾丝蛋白
噬菌体TFPs呈带状附着在尾板上，主要由起连接支撑作用的臂和一个特异性的末端结构组成。目前报道的大多数TFPs结构具有相似度很高的由含β-螺旋的同源三聚体组成的臂，此结构的形成受到尾丝中包含的C末端分子内伴侣结构域的调控。相似的臂结构表明TFPs末端形状及大小的不同决定了其功能的多样性。如常见的T4噬菌体TFPs末端呈条状（图1），其中由gp37编码的长TFPs参与噬菌体的特异性识别，能够与细菌表面脂多糖和外膜蛋白发生可逆性结合，由gp12编码的短TFPs不具有特异性功能，但能够与细菌表面脂多糖发生不可逆结合以加强吸附；T7噬菌体TFPs末端呈球状，只能特异性识别细菌表面的脂多糖。除形态不同外，一些噬菌体尾丝末端具有额外的独立蛋白结构，包括黏附蛋白、组装蛋白等。
与常见的T家族噬菌体TFPs不同，一些噬菌体尾丝的前端臂结构同样具有多样性，且在结合过程中具有一定的铺助功能。如不同种类的铜绿假单胞菌噬菌体尾丝的臂结构间差异较大且差异位点较为集中，差异区域大小与常见的多糖结合位点大小接近。虽然噬菌体短暂的生长周期会使蛋白中出现很多不影响功能性的基因突变并遗传下去，但这些突变应该无规律地出现在蛋白质各区域。
1.2 尾刺蛋白
TSPs的结构组成与TFPs相似，包含C末端配体结合区域与N末端连接结构域。与柔软的TFPs不同，TSPs的构象更为稳定，结构更加坚硬，在实验研究中更容易处理观察，目前针对TSPs结构的解析相对更加完整清晰。TSPs的配体结合区域由两个及以上的结构域组成，其中至少包含一个具有不同酶活性的结构域，可与细菌表面对应结构结合。如葡萄球菌噬菌体F11的TSPs末端具有螺旋形结构域，能与金黄色葡萄球菌表面的磷壁酸中乙酰氨基葡萄糖结合；克雷伯菌噬菌体PSA的TSPs含有能够降解细菌表面荚膜多糖的结构域；大肠杆菌噬菌体CBA120的TSPs包含一个β-螺旋糖苷酶结构域，能够与大肠杆菌表面的O抗原结合。大多数TSPs会将其反应底物彻底分解为小分子化合物，使得噬菌体能够直接与细胞膜接触。与TFPs不同，不同噬菌体TSPs中所包含的具有相同底物酶活性的结构域相似度极高，配体结合区域成为TSPs中最保守的部分，也是在宿主识别中起关键作用的区域。如噬菌体63D与K1-5整体差异极大，但TSPs中编码内切酶的序列相似度达到了96%。 有研究指出配体结合区域中其余结构域在宿主识别中可能起到铺助吸附的作用，但具体功能尚不明确。
TSPs通过N末端结构域与其余TFPs及尾板连接，此结构域组成简单且高度保守，最小可能仅由数个氨基酸构成。与具有酶活性的结构域相同，很多不同种类的噬菌体的连接结构域表现出惊人的相似性，如典型的由T4噬菌体gp10编码的连接结构域已经在多种不同家族的噬菌体中检出。
基于TSPs和TFPs结构与功能的相似性，有研究者提出TSPs是噬菌体在和细菌长期的共同进化中针对细菌的保护性措施以TFPs为基础进化而来的。比较可信的推论是噬菌体在感染细菌的过程中，在细菌体内将细菌本身的分解代谢酶整合至受体结合蛋白中，从而获得穿越细胞膜外结构的能力。这种进化具有两面性，一方面，它帮助噬菌体克服了细菌的保护措施，增强了噬菌体对细菌的特异性感染能力；另一方面，它也在一定程度上限制了噬菌体的宿主谱，目前报道的TSPs通常只能识别一种或几种十分相似 的底物。为了加强与宿主结合作用，一些噬菌体如李斯特菌噬菌体A511及乳球菌噬菌体TP901等在尾部整合了数量巨大的相同的受体结合蛋白，另一些噬菌体则是在尾部构建了多种不同类型的TSPs以扩大宿主范围。
1.3 其余结构
除了TFPs与TSPs两种结构外，少数噬菌体如乳球菌噬菌体P936等的蛋白质外壳上还存在一些碳水化合物结合模块（CBMs），包含颈部通道蛋白、主要尾蛋白及末端尾蛋白等。这些外壳蛋白上附着的CBMs同样存在与受体结合蛋白相似的特异性结构域，能够与细菌表面的胞外多糖等结构进行特异性结合，在一定程度上影响噬菌体宿主范围。
虽然近年来许多常见噬菌体的受体结合蛋白的结构已经被初步解析，但仍有多种结构域的功能尚不明确，有关受体结合蛋白与细菌结合机制的研究尚处于初级阶段。目前食品原料、养殖、运输等过程中所使用的噬菌体抑菌剂成本相对较高且难以彻底清除细菌，长期使用会使细菌对噬菌体产生抵抗性。对受体结合蛋白结构进行研究有助于人们深入了解噬菌体与细菌相互作用的机制，鉴定噬菌体在食品领域中应用的安全性，降低新型噬菌体抑菌剂的开发成本，对明确作用机制的噬菌体抑菌剂可通过调节环境条件降低细菌对噬菌体抗性的产生并提高杀菌效率。此外受体结合蛋白结构功能的解析可为噬菌体在食源性致病菌的快速检测与基因工程噬菌体方向提供研究基础。
2
噬菌体宿主谱扩展
自然界中噬菌体野生株宿主范围通常十分狭窄，一株噬菌体只能够裂解一种细菌中的一株或少数菌株。细菌对噬菌体的抗性可能是其本身细胞天然存在的，也可通过长期与噬菌体相互作用之后进化获得。常见食源性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌等血清型众多，实际应用中单一天然噬菌体难以应对多种细菌并存的复杂环境。
如何突破噬菌体宿主范围的限制已经成为目前噬菌体相关研究的重要方向之一，目前常见的方式有4 种：1）通过调整宿主菌种类、数量等方式直接从自然界中分离筛选宽谱噬菌体；2）通过改变培养条件并连续培养诱导噬菌体宿主范围发生改变从而获得宽谱噬菌体；3）通过将多种宿主范围不同的噬菌体组合制作成噬菌体“鸡尾酒”扩大宿主范围；4）利用基因工程定向改造噬菌体扩大其宿主谱。
2.1 诱导实验扩展噬菌体宿主谱
在噬菌体与细菌长期的协同进化中，细菌本身就是一种推动噬菌体进化的重要力量。噬菌体感染过程中将自身遗传物质输入宿主细胞，期间其本身的基因突变及与来自环境和细菌内部的大量外源性遗传物质进行的随机的体内同源重组使噬菌体基因组发生变化，经自然筛选后对自身有益的改变得以保留，其中大部分为噬菌体宿主范围的受体结合蛋白及相关结构的变化。噬菌体这种进化很大程度上受到生长环境与生长模式的调控，因此很多研究者尝试通过创造特殊的生长条件与培养方法诱导扩大目标噬菌体的 宿主谱。目前噬菌体基因层面的研究还处于初级阶段，这种非靶向扩谱方法仍是实验室与工业化快速大量扩展噬菌体宿主谱的主流方案。
在各国研究者长明间的努力与尝试中，诱导实验的方法与条件逐渐优化完善，目前已经形成了一些较为成熟的体系。早期的诱导实验方案一般比较简单但耗时较长，如徐焰将大肠杆菌噬菌体XY-1分别与对其不敏感的其余大肠杆菌及金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌等其他种属细菌交叉连续培养，最终成功获得一株对多株大肠杆菌敏感且遗传稳定的噬菌体，最高能够清除养殖环境污水中65%的大肠杆菌。
2.2 噬菌体“鸡尾酒”制剂扩展宿主谱
噬菌体“鸡尾酒”的广义概念是指由多种不同噬菌体组成的混合物，这些混合物通常对多株细菌敏感。由于不同噬菌体的结构与感染机制存在差异，“鸡尾酒”中各噬菌体成分能够识别相同或不同细菌的不同受体，自然地拥有了较为广泛的宿主范围。目前常见的致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）及铜绿假单胞菌都已开发出安全可靠的噬菌体“鸡尾酒”产品（表1）。
虽然从理论上讲，噬菌体“鸡尾酒”能够很容易在简单组合后裂解多种细菌，但是在实际研发过程中很多因素限制了噬菌体“鸡尾酒”的效果。首先噬菌体之间可能存在“不兼容”的情况。在噬菌体“鸡尾酒”各成分的共感染中不同噬菌体由于感染机制及代谢产物等方面的互相影响会产生协同或拮抗作用，导致其中一些噬菌体感染能力下降甚至死亡。除此之外，在噬菌体作用过程中经常会出现对噬菌体具有抗性的细菌，一般情况下噬菌体也会进化出对抗性菌株具有裂解能力的噬菌体突变株，但在处理形成了生物膜的细菌明，噬菌体进化株在“鸡尾酒”环境下经常难以增殖到足够的数量，这导致噬菌体“鸡尾酒”在对抗噬菌体抗性细菌方面不如单一 噬菌体。解决上述问题要求研发者开发新型噬菌体“鸡尾酒”明在保证宿主范围的情况下尽可能减少噬菌体多样性，同明在菌株选择上应尽量选择具有不同受体结合蛋白类型的噬菌体作为原料并及明更新“鸡尾酒”组成，在噬菌体“鸡尾酒”使用过程中小剂量连续多次给药或直接过量给药也是可行方案。
2.3 基因工程噬菌体扩展宿主谱
基因工程噬菌体是指通过基因突变、基因替换或整合外源基因等方式有目的性地改造噬菌体的遗传物质，从而扩大噬菌体的宿主范围及对细菌的裂解能力。通常基因突变与替换技术被使用在与噬菌体尾部蛋白合成相关的基因改造中，通过直接改变噬菌体的受体结合蛋白的结构从而影响噬菌体宿主谱；也有一些研究者将特定的基因整合至噬菌体基因组的非功能区，通过整合基因的产物增强噬菌体的杀菌能力从而间接扩大噬菌体宿主谱（图2A）。
2.3.1 直接改造尾部蛋白扩大宿主谱
噬菌体尾部蛋白是其发挥特异性识别作用的关键性结构，通过对尾部结构及基因相似度较高的不同噬菌体之间进行整体或部分同源重组和突变可改变其宿主范围（图2B）。
完全交换尾部或部分交换尾部组件是基因工程噬菌体中常见的改造方法，需要替换的结构域在边界上具有一定的序列相似 性（图2B）。Ando等利用噬菌体对真菌没有损害的特点创建了一个基于酵母的平台。 目前基于此平台已经出现很多成功案 例。该平台在体外通过小DNA片段直接组装合成噬菌体基因组，能够完全不受限制地进行基因设计与编辑，且不依赖于宿主菌的转化和重组效率，规避了重组过程中宿主体内潜在毒性基因的威胁。
相比大量交换尾部组件，定向改造噬菌体受体结合蛋白是一种更加精确但难度较高的方案，用于同源重组的受体结合蛋白必须具有极高的序列相似性和明确的结构与功能，主要通过电转化DNA将噬菌体受体结合蛋白基因转入细胞进行同源重组，然后通过CRISPR/Cas系统进行反向选择除去未发生突变的野生株，目前常见于T家族噬菌体的改造。Lin Tiaoyin等将T3噬菌体的一部分受体结合蛋白基因替换为T7噬菌体的基因，经测试改造后的噬菌体获得了更宽的宿主谱与更好的裂解能力（图2C）。
2.3.2 插入外源基因间接扩大宿主谱
噬菌体的受体结合蛋白并非限制噬菌体宿主范围的唯一因素。最新研究表明，细菌体内的特异性防御机制同样可以调控噬菌体的裂解能力，例如修饰限制系统R-M type I，基于DNA磷酸化的防御系统Dnd等。细菌体内的防御机制具有高度多样性，其主要位于可移动的遗传元件上，并且在单个基因组内经常存在多种防御机制。一些噬菌体在此影响下完成初步吸附后无法进行后续侵染过程，仅能对细菌的部分结构造成损伤且后续无法检出活噬菌体，通过表观遗传和基因组修饰能够帮助噬菌体适应细菌防御并改变宿主范围。
另一种增强裂解能力的方法是直接将毒力基因 插入噬菌体基因组中。细菌生物膜由蛋白质、DNA与胞外多糖组成，能够极大加强细菌的抗逆性，一定程度上阻止噬菌体与细菌的接触从而降低噬菌体的感染能力 。Lu等将生物膜降解酶DspB基因整合至T7噬菌体中，使得改造后的噬菌体可除去99%的生物膜，杀菌效果提升了两个数量级，解决了噬菌体抗性细菌的问题，为噬菌体宿主范围扩展提供了新思路（图2D）。
插入外源基因的目的一般是为了加强噬菌体本身对细菌的裂解能力及改善噬菌体的反应环境，在噬菌体宿主谱扩展能力上相比对尾部结构进行直接改造略显不足。由于噬菌体衣壳蛋白的存在极大限制了基因组大小的改变，可插入的外源基因比较有限，因此多与抗菌药物及其他化学药物联合使用。
经过数十年的探索，非定向噬菌体宿主谱扩展技术如今已经相对完善，许多国外生物公司已经运用此项技术工业化生产优质宽谱噬菌体以用于食品领域噬菌体抑菌剂的研发和噬菌体“鸡尾酒”的更新，我国由于目前尚未设立噬菌体作为食品添加剂及生物防治剂的相关标准，噬菌体抑菌剂的发展还处于起步阶段。相比非定向培育方法，基因改造定向扩展噬菌体宿主谱在安全性及遗传稳定性方面更方便更有优势，针对食品原料养殖和即食食品杀菌的需求生产所需要的特定噬菌体，更加符合未来食品行业的发展需求，具有良好的发展前景。
3
结 语
综上所述，噬菌体作为自然界最丰富的物种之一，人们对其认知还有很多不足。虽然目前噬菌体在食品领域的可接受程度还相对较低，但随着食品行业的快速发展与科技水平的进步，噬菌体必将成为控制食源性致病菌的优秀替代品之一。近年来对噬菌体的结构功能及作用机制的研究使人工改造噬菌体技术获得了重大突破，但还需进一步丰富噬菌体基因库来确保噬菌体在食品领域中应用的安全性与稳定性，加强基因工程噬菌体的研发，并推动噬菌体的基础研究走向食品工业化应用将会是未来研究的趋势与热点。
通信作者：
张德福副教授
渤海大学食品科学与工程学院
硕士生导师，主要从事食源性致病菌快速检测与生物防控及相关方面的教学与科研工作，主持有“十三五”国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项子课题、国家自然科学基金青年基金、中国博士后科学基金面上项目等。目前主要开展噬菌体生物学、基因组学及其在食品安全检测与致病菌控制中的应用。
第一作者：
李 凡硕士研究生
渤海大学食品科学与工程学院
学习经历：
1.2015/9-2019/6，山西大学生命科学学院，攻读学士学位，专业：食品科学与工程，导师：张小民副教授；
2.2020/9-2023/6，渤海大学食品科学与工程学院，攻读硕士学位，专业：食品科学，导师：张德福副教授。
本文《噬菌体受体结合蛋白及其宿主谱扩展的相关研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷23期252-260页. 作者：李凡，于振兴，张明，林洪，李学鹏，励建荣，张德福. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221203-031. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为进一步促进未来食品科学的发展，全面践行“大食物观”的指导思想，持续提升食品科技创新和战略安全。由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，北京工商大学食品与健康学院、北京联合大学生物化学工程学院、河北农业大学食品科技学院、西华大学食品与生物工程学院、大连民族大学生命科学学院、齐齐哈尔大学食品与生物工程学院、河北科技大学食品与生物学院共同主办，北京盈盛恒泰科技有限责任公司、古井集团等企业赞助的“第一届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于 2024年5月16-17日 在 中国 北京 召开。
长按或微信扫码了解详情
为提高我国食品营养与安全科技自主创新和食品科技产业支撑能力，推动食品产业升级，助力‘健康中国’战略，北京食品科学研究院、中国食品杂志社将与湖北省食品科学技术学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物研究所、中南民族大学、湖北省农业科学院、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室、武汉食品化妆品检验所、国家市场监管实验室（食用油质量与安全）、环境食品学教育部重点实验室共同举办“第五届食品科学与人类健康国际研讨会”。会议时间： 2024年 8月 3—4 日 ，会议地点： 中国 湖北 武汉 。
长按或微信扫码了解详情