本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。
Introduction
非酶糖基化反应是指还原糖的羧基与蛋白质或肽的游离氨基发生的亲核加成反应，其中游离赖氨酸、精氨酸和N端是潜在的糖基化位点。在健康人体内，蛋白非酶糖基化反应缓慢，但在糖尿病患者中，高血糖会加速血红蛋白和血清白蛋白的非酶糖基化进程。血红蛋白是胞内蛋白，细胞内葡萄糖会与其发生非酶糖基化反应。糖基化血红蛋白是糖尿病患者的重要指标，可反应血液中2～3个月内的平均血糖水平。相比于血红蛋白，血清蛋白潜在糖基化位点（赖氨酸和精氨酸残基）多，更易发生非酶糖基化，是血清中主要的非酶糖基化蛋白。
人血清白蛋白（HSA）是血液中最丰富的蛋白，具有运输营养物质、调节血浆pH值和脂质代谢、维持渗透压等多种功能。由于HSA半衰期长（14～20 d）且含有大量游离赖氨酸和精氨酸残基（85个糖基化位点），易与还原糖发生非酶糖基化反应。在糖尿病患者中，HSA比其它蛋白质更易发生非酶糖基化，约占血液中总非酶糖基化蛋白的80%。糖基化会改变HSA的二维和三维结构，影响其生物活性，并形成晚期糖基化末期产物（AGEs）、活性氧和羰基等化合物，会对器官和组织造成不可逆的损害。据报道，HSA过度糖基化会抑制细胞葡萄糖摄取和引发机体炎症。此外，体内AGEs过度积累会增加心血管疾病、肾脏损伤、阿尔茨海默病和视网膜损伤等糖尿病并发症的发病率。因此，抑制HSA糖基化对于缓解糖尿病及其并发症具有重要的意义。
鞣花单宁（ET）广泛存在于水果和坚果中，具有多种生物活性，但其胃肠道吸收率低。在胃和肠道消化阶段，ETs会水解产生六羟基二苯甲酰基（HHDP）基团而转化为鞣花酸（EA）。部分EA在胃肠道被吸收，而未被吸收的EA会被肠道微生物代谢，产生大量的3,8-二羟基-6H-二苯并吡喃-6-酮型衍生物，如尿石素A（UroA）、尿石素B（UroB）、尿石素D（UroD）和尿石素C（UroC）（图1）。尿石素类化合物（Uros）比ET和EA更易于吸收，且具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病和抗肥胖等多种生物活性。然而，ET的代谢产物EA和UroA-D抑制HSA糖基化作用及其分子机制还尚不明确。
江西师范大学生命科学学院博士生彭春彦、张露教授和健康学院谢星博士等，首先评估了EA和UroA-D对HSA非酶糖基化产物生成的抑制作用；其次，采用荧光光谱法等方法探究了EA和UroA-D对糖基化过程中HSA结构的影响；最后，结合MGO捕获能力、自由基清除能力和糖基化位点等指标阐明EA和UroA-D抑制HSA糖基化的分子机制。本研究可为EA和Uros作为糖基化抑制剂开发用于预防和治疗糖尿病提供理论基础。
Results and Discussion
果糖胺、二羰基化合物、荧光AGEs、游离氨基是蛋白糖基化过程中的关键产物。如图2所示，EA和UroA-D对HAS糖基化过程中果糖胺的生成无抑制效果，但能显著抑制二羰基化合物、荧光AGEs的生成，并增加游离氨基酸的含量（P＜0.05），其中EA、UroC和UroD的抑制能力显著优于其它化合物（P＜0.05）。以上结果表明EA和UroA-D可延缓HSA的非酶糖基化进程。
图2EA和UroA-D对HAS糖基化过程中果糖胺（A）、α-二碳基化合物（B）、荧光性AGEs（C）和游离氨基（D）形成的影响
进一步分析了EA和UroA-UroD对HSA糖基化过程中色氨酸、游离巯基等氧化产物形成的影响。如图3所示，未糖基化和糖基化HSA（G-HSA）的荧光强度分别为148.33和59.64（色氨酸残基相对含量），表明在G-HSA中有59.79%的色氨酸残基被氧化（图3A）。EA和UroD分别使G-HSA荧光值提高了45.00%和54.81%，UroA和UroB 使G-HSA的荧光值显著降低，而UroC和AG对G-HSA荧光值无显著影响（P＞0.05）。Uros的抑制能力可能与其二苯并吡喃-6-酮环上的酚羟基数目相关，酚羟基数目越多，效果越好。如图3B所示，未糖基化HSA中游离巯基的含量为20.50 μg/mL，糖化后其含量下降至9.95 μg/mL。EA和UroD的游离巯基含量最高，其值分别为17.31和21.96 μg/mL；UroA次之，含量为14.77 μg/mL；UroB和UroC含量最低。以上结果表明EA和UroA-D能缓解HSA非酶糖基化引起的氧化损伤，UroD的效果最佳。
非酶糖基化会导致蛋白质结构的变化，通过测定蛋白聚积程度和分子量研究了EA和UroA-D对非酶糖基化HSA结构的影响。如图4A所示，未糖基化的HSA荧光强度值最低（370.91），糖基化后荧光值增加至588.53，表明糖基化加剧了蛋白质的聚集和纤维化。添加EA、UroB和UroD后，G-HSA的荧光值分别下降了28.5%、21.5%和22.8%，UroA、UroC和AG的抑制效果显著弱于它们（P＜0.05）。由图4B可知，未糖基化HSA在约68 kDa处有明显的深色条带，而G-HSA的深色条带轻微上移，表明HSA发生了糖基化反应。添加EA、UroC和UroD后，其蛋白条带颜色加深，表明其可减轻糖基化诱导的HSA分子量增加和条带分散。以上结果表明EA和UroA-D可缓解HSA糖基化诱导的蛋白淀粉样聚集和分子量增加。
图4 EA和UroA-D对糖基化HSA的纤维状态（A）和分子量（B）的影响
分子对接是研究小分子化合物与蛋白质大分子之间相互作用的常用方法。HSA的两个主要结合位点为子域IIA和子域IIIA，小分子化合物更倾向于在子域IIIA与HSA结合。分子对接结果显示，EA和UroA-D与HSA的结合能分别为-44.97、-16.27、-20.43、-7.73和-38.73 kcal/mol，其中EA与HSA的结合能力最强，其次是UroD。如图5所示，EA、UroA-D与HSA分别形成了3、2、2、3和3个氢键。此外，EA和UroA-D也可通过Pi-cation和Pi-alkyl相互作用与HSA结合。以HSA-EA复合物为例，EA的羟基或醛基与HSA的Arg410、Tyr411和Leu430残基形成了3个氢键，与Leu407、Leu453、Val433和Arg485残基形成了Pi-alkyl相互作用。
为了更好地阐明EA和UroA-D抑制HSA糖基化的机制，使用纳米液相色谱-串联质谱分析法（nano LC-orbitrap-MS/MS）鉴定了HSA的糖基化肽段和位点。通过与Uniport数据库比对母离子（m/z）和碎片离子（b系列和y系列离子）确定了HSA的糖基化肽段序列及位点。如图6A所示，肽段290-LKECCEKPLLEK-310的m/z为387.45384+，当结合1和2个葡萄糖时，发生40.5132和81.026 1的质量偏移，在427.96684+和468.47994+处出现m/z响应值。未糖基化和糖基化模式下，肽段589-ET(CAM)CFAEEGKK-598的m/z分别为400.18423+和454.20173+，m/z的偏移量为54.0171（图6B），表明肽段589−598结合了1个葡萄糖。C8和C9的m/z分别为941.3629和1231.5087，质量偏移量为290.1458，表明1分子葡萄糖的结合在Lys597上。另外，肽段585～598（ADDKETCFAEEGKK，图6C）具有三个潜在的糖基化位点（K588、K597和K598），但仅在C4（m/z 609.2679）和C3（m/z 319.1232）、C13（m/z 1822.7571）和C12（m/z 1532.6018）观察到质量偏移为290，表明1分子葡萄糖结合在Lys588/Lys597残基，则Lys588/Lys597是糖基化位点。
如表1所示，在G-HSA中鉴定出11个糖基化位点，分别为Lys130、Lys186、Lys300、Lys305、Lys341、Lys499、Lys549、Lys558、Lys588、Lys597和Lys598。添加EA和UroA-D后，糖基化位点的数量分别为10、10、11、7和10。添加UroC后，G-HSA糖基化位点Lys186、Lys305、Lys341、Lys499、Lys597和Lys598消失，但新增加了糖基化位点Lys214和Lys569。EA屏蔽了G-HSA中糖基化位点Lys186、Lys305、Lys499和Lys598，新增糖基化位点Lys36、Lys161和Lys438。UroA和UroD的效果类似EA，仅减少1个糖基化位点。UroB对G-HSA的糖基化位点数量无影响，但改变了糖基化位点的氨基酸序列。以上结果说明EA和UroA-D对HSA的糖基化位点均有影响，且UroC效果最显著。
图6 糖基化肽290−310，m/z为468.479 94+（A），糖基化肽589−598，m/z为454.20173+（B）的质谱糖基化肽589−598（C）和肽585−598（D）的HCD图谱
丙二醛（MGO）是典型的二羰基化合物，其能攻击蛋白质的自由氨基形成荧光糖基化终产物（AGEs），捕获MGO可有效降低荧光性AGEs的形成。因此，评估了EA和UroA-D捕获MGO的能力，以进一步解析EA和UroA-D抑制HSA糖基化的机制。如图7A所示，当EA和UroA-D的浓度为90 μmol/L时，其MGO捕获能力分别为72.92%、7.80%、69.15%、46.37%和89.72%，其中UroD的MGO捕获能力最强，EA和UroB（P＜0.05）次之，但均显著强于阳性对照AG（49.99%）。如图7B和C所示，当样品浓度为250 μmol/L时，EA、UroC和UroD表现出较强的DPPH·清除能力，其清除能力顺序为EA（76.68%）＞UroD（68.34%）＞UroC（47.24%），而UroA、UroB和AG的DPPH·的清除能力较弱。另外，UroD的ABTS·+清除能力最强，其次为EA和UroC（P＜0.05），UroB最弱。因此可见，EA和UroA-D可通过捕获MGO、清除DPPH·和ABTS·+达到抑制HSA糖基化的效果。
Conclusion
综上所述，Uros对G-HSA的抑制与其酚羟基的数量有关，其中EA、UroC和UroD的抑制HSA非酶糖基化的能力最强。UroD抑制荧光AGEs形成的能力最强，其抑制率为69.31%。EA和UroD显著HAS糖基化过程中提高色氨酸残基、游离氨基和游离巯基水平，减少HSA糖基化导致的淀粉样蛋白聚集。EA和UroA-D主要通过诱捕MGO、清除DPPH·和ABTS·+自由基和屏蔽糖基化位点等途径缓解HSA的非酶糖基化进程。本研究可为EA和UroA-D作为抗糖基化剂开发提供理论基础。
第一作者
彭春彦，男，现为江西师范大学生命科学学院博士研究生，主要研究方向天然产物组分与食品组分相互作用。以第一作者在国内外期刊发表论文3篇，其中SCI一区论文2篇。
通信作者
谢星，男，江西师范大学健康学院讲师，中共党员，博士毕业于华南理工大学，硕士生导师。主要从事天然植物小分子(多酚类化合物)和大分子(蛋白)之间相互作用与植物中功效成分提取和活性评价方面的研究。在国内外学术期刊发表论30余篇，其中以第一或通讯作者在Food & Function和LWT等杂志发表10余篇，主持江西省自然科学基金项目和江西省教育厅项目各1项；指导学生获中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛全国银奖、全国大学生生命科学竞赛二等奖。
张露，教授，博士生导师，国家淡水鱼加工技术研发专业中心副主任，江西省“双千计划”科技创新高端人才，江西省青联联合会十一届委员会委员，中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程专业委员会理事，中国海洋学会海洋中药专业委员会委员江西省（省本级）特殊食品技术专家、江西省青年科技工作者协会成员等。在功能性食物资源开发和高值化利用方面开展了系列工作，发现了动态高压微射流技术辅助提取活性成分的“协同增效”和“尺寸减小”效应；构建了藜蒿、甘薯叶等10余种植物资源中主要活性成分的指纹图谱，以及复杂体系中抗氧化剂在线筛选方法和酶抑制肽的高通量筛选鉴定方法。主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金等国家和省部级项目10项，主要参与国家重点研发计划项目、国家自然科学基金等国家和省部级项目16项，发表学术论文80余篇，其中SCI论文60余篇，获省部级科研奖励5项，国家授权发明专利17件，指导本科生参加“互联网+”大学生创新创业大赛、全国大学生生命科学竞赛等获国家和省级奖励5项。同时，通过技术服务、联合技术攻关、产品开发等对接服务煌上煌集团有限公司、华润江中、江西德上制药有限公司、江西倍得力生物工程有限公司等企业8家。
Effect of ellagitannin metabolites ellagic acid and urolithins A-D on the non-enzymatic glycation of human serum albumin and inhibiting mechanisms
Chunyan Penga, Wenna Zhoua, Xing Xiea,b,*, Feiyan Lua, Linju Xua, Qinghui Wena, Zongcai Tua,c, Lu Zhanga,*
a National R&D Center of Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China
b College of Health, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China
c State Key Laboratory of Food Science and Resources, Nanchang University, Nanchang 330047, China
*Corresponding author.
Abstract
Effect of ellagitannins gut microbiota metabolites ellagic acid (EA) and urolithin A-urolithin D (UroA-UroD) on human serum albumin (HSA) glycation were firstly evaluated in this research. The inhibition mechanisms were investigated by methylglyoxal (MGO) trapping and radical scavenging ability assays, docking studies and nano LC-orbitrap-MS/MS technology. Results indicated that the inhibition of urolithins on HSA glycation was highly positive correlated with the number of phenolic hydroxy groups. Addition of UroD and EA could effectively enhance the content of free amino group, suppress dicarbonyl compounds and advanced glycation end-products (AGEs) formation, alleviated tryptophan and protein oxidation, inhibited HSA amyloid-like aggregation. They could also trap MGO and scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical (DPPH·) and 2,2’-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid free radical (ABTS+·). Molecular docking indicated that EA and UroA-UroD interact with HSA mainly through hydrogen bound and hydrophobic interaction, among which 2 or 3 hydrogen bonds were formed. The number of glycation sites were reduced from 11 to 10, 10, 7, and 10, respectively, when 90 μmol/L of EA, UroA, UroC and UroD were added. However, weak inhibition was observed on UroA and UroB. These findings can provide scientific evidence for the application of ellagitannins-rich foods in alleviating diabetic complications.
Reference:
PENG C Y, ZHOU W N, XIE X, et al. Effect of ellagitannin metabolites ellagic acid and urolithins A-D on the non-enzymatic glycation of human serum albumin and inhibiting mechanisms[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250107. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250107.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、 重庆市农业科学院、 重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、重庆三峡学院、西华大学、成都大学、四川旅游学院、西昌学院、北京联合大学协办的“ 第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会 ”， 将于2026年4月25-26日 （4月24日全天报到） 在中国 重庆召开。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）