读：季节性流感病毒感染每年在全球范围内造成重大疾病和经济负担，仅2022-2023年美国就有超过三千万的流感病例，经济损失约250亿美元。虽然已经有季节性流感疫苗，但由于其研发、制备周期较长，以及流感病毒的抗原性漂移，使得疫苗的有效性并不高。全球在每年仍可能有25-50万人死于流感相关疾病。目前，编码病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)两种糖蛋白的mRNA是非常有力的新一代流感疫苗，其具备多重保护性免疫反应，且具有持久性。然而，单独递送两种抗原会使得生产复杂化、成本增加。
2024年10月8日，杜克大学Nicholas S Heaton携手mRNA诺奖得主Drew Weissman，在Nature Communications上发表题目为
“Improved influenza vaccine responses after expression of multiple viral glycoproteins from a single mRNA”的研究型文章。文章显示，他们开发了一种mRNA遗传构型，允许从单个开放阅读框Open reading frame, ORF)同时表达未修饰的全长病毒NAHA蛋白。他们将这种方法应用到当季的甲型和乙型流感病毒，在接种疫苗后观察到高水平的功能性抗体，并且可以保护雌性小鼠和雄性雪貂免受病毒株攻击这是对mRNA技术的又一改进使用，以天然状态高效递送多种病毒抗原，提高了季节性疫苗的功效。
发表期刊: Nature Communications
发表时间: 2024年10月
分区/影响因子: 1区/IF=14.7
应用技术: 体外转录、mRNA-LNP、动态光散射(DLS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、血凝抑制试验(HAI)、酶联凝集素测定(ELLA)、神经氨酸酶抑制测定(NAI)、微量中和试验(MN50)、噬菌斑减少中和试验(PRNT50)、实时定量反转录PCR(qRT-PCR) 等。
01
季节性流感疫苗研究进展
疫苗是对抗季节性流感病毒感染的重要手段，但由于病毒抗原的快速漂移，每年都要根据流行毒株重新制备流感疫苗，一般预防的4种流感病毒株为甲型流感病毒H1N1、H3N2以及乙型流感Victoria/Yamagata。虽然FDA已批准了亚单位疫苗、重组蛋白疫苗以及减毒活疫苗用于流感的预防，但目前使用最广泛的仍为鸡胚中制备得到的灭活疫苗。由于，灭活疫苗需要6-8个月相对较长的生产周期，流行菌株大概率已发生突变。因此，季节性流感疫苗对某些病毒亚型预防效果急剧降低，报道的有效性仅为20-60%。mRNA技术是新一代流感疫苗有力途径。这些疫苗由编码特定抗原的mRNA序列组成，包封在脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles, LNP)中，可以诱导强大的体液免疫和细胞免疫。由于它们不会产生传染性病毒，因此这些疫苗被认为可以安全地用于免疫功能低下人群、老年人以及儿童，且易于制备。
关于相关抗原的选择，NA和HA糖蛋白已成为流感疫苗的核心靶点。由于HA抗原可以产生中和抗体，NA定向抗体可以提高疫苗保护的广度并限制疾病进程。此外，NA是一种更保守的病毒蛋白，其抗原漂移速度比HA慢，因此已证明广泛反应性NA抗体可在NA亚型内和跨NA亚型之间提供交叉反应保护。而且疫苗设计也越来越倾向于多种病毒糖蛋白的同时递送，以实现最大程度的疫苗诱导保护。对于递送多种抗原的mRNA-LNP疫苗，一般都会将病毒蛋白编码在单独的mRNA序列中，在接种疫苗前混合。这种方式可有效地引发部分抗体反应，但较为复杂、成本更高，而且这种糖蛋白缺乏协调的共表达。
02
单个mRNA共表达NA和HA
目前，病毒2A位点已被广泛用于促进来自同一序列的多个单个蛋白质的表达，但该种方法会在分离蛋白质的末端残留氨基酸片段。因此，作者又参照了猪捷申病毒2A (Porcine teschovirus 2A, PTV-2A)以弥补上述不足。
首先，作者使用流行性H3N2病毒的序列A/Tasmania/503/2020，通过NA-F2A-HA构建体编码了NA、HA糖蛋白(图1a)。文中使用的HA和NA序列都经过了密码子优化，以增强蛋白质表达并降低免疫原性。序列中poly(A)尾为100 nt，在合成mRNA时进行了共转录加帽，随后通过沉淀和纤维素色谱方法完成纯化。
在ELISA和显微镜中，作者发现用该质粒转染的细胞与用单独编码抗原或混合物质粒转染的细胞表达相似水平的NA和HA(图1b-1e)。同样，共聚焦显微镜结果显示这些蛋白质都实现了正确的表达和运输（图1f）。此外，作者还发现该质粒表达的HA可以介导与单独表达HA相似的膜融合活性（图1h）。上述结果表明，NA-F2A-HA的设计确实可以应用于疫苗设计，以从单个ORF表达两种功能性天然病毒蛋白。
图1 NA和HA可以从单个DNA构建体中正确表达
03
NA+HA共表达mRNA疫苗的免疫原性
接下来，作者在小鼠身上比较了分别编码NA、HA、NA-F2A-HA的mRNA-LNP疫苗。疫苗接种后血清结果显示，单独编码NA或HA的mRNA-LNP疫苗引发了针对靶向A/Tasmania/503/2020蛋白的强烈抗体反应。而接种NA-F2A-HA mRNA-LNP疫苗的小鼠对两种病毒蛋白的抗体反应相似(图2b-2e)，因此作者认为HA和NA都得到了适当的表达。紧接着，作者又通过微量中和试验(Multicycle microneutralization, MN50)和噬菌斑减少试验(Plaque-reduction, PRNT50)等手段对抗体的有效性进行了评估，结果显示NA-F2A-HA mRNA构建体递送两种抗原与其他任何组别相比都具有非劣效性(2f-2i)。随后，作者又用致死剂量的适应抗原相似的H3N2病毒（A/Switzerland/9175293/2013）攻击接种疫苗的小鼠，以评估疫苗的保护性能。结果，接种上述疫苗的小鼠引发了针对两种糖蛋白的免疫反应，在感染后均存活下来且可以防止更为致命的攻击，产生的免疫反应类似于接种单独、混合编码抗原的mRNA-LNP，其保护性能相对于当前的行业标准疫苗。
图2H3N2 NA-F2A-HA mRNA-LNP对两种抗原的免疫原性
而且，作者将该疫苗的设计由起始的甲型流感H3N2拓展到了H1N1 A/Victoria/2570/2019、IBV_V B/Washington/02/2019和IBV_Y B/Phuket/3073/2013其他三种病毒株，并分别免疫小鼠(图3a)。疫苗接种后，根据血清分析显示，三种NA-F2A-HA mRNA-LNP疫苗与荧光素酶mRNA-LNP和灭活疫苗Flulaval相比，均显著升高了各自NAs和HAs的抗体反应(图3b-3o)。表明这种疫苗设计对其他流感病毒亚型也具有卓越的免疫原性。
图3NA-F2A-HA mRNA-LNP对其他流感病毒亚型有卓越的免疫原性
04
四价mRNA疫苗流感的小鼠保护效应
在后续的试验中，作者探索了编码H1N1、H3N2、IBV-Y或IBV-V毒株的NA-F2A-HA四价mRNA-LNP疫苗混合物，是否具备同时表达所有病毒类型的NAs和HAs的功效，以达到“八价”疫苗的效果。作者在小鼠身上接种了等量的NA-F2A-HA mRNA-LNP疫苗混合物，上述四种mRNA-LNP的剂量是单独给药时的一半(图4a)。如图4b-4e所示，我们可以看到这种疫苗混合物确实对所有四种疫苗株的NAs和HAs产生强烈的抗体反应，不劣于Flulaval疫苗接种后引发的抗体水平。同时，根据PRNT50测定结果，作者发现mRNA-LNP疫苗引起的中和病毒抗体水平明显更高，并且比接受Flulaval疫苗的动物反应更强(图4f-4i)。随后，文章在接受了mRNA-LNP疫苗混合物的小鼠身上，用致命剂量的H1N1、H3N2、IBV_Y三种病毒对其进行攻击(图4j-4l)。结果显示，所有接种了四种mRNA-LNP混合物或Flulaval的小鼠都完全免受所有病毒的致命攻击，而接种荧光素酶mRNA-LNP的小鼠在感染后7-10天内死亡(图4m-4o)。此外，在H3N2和IBV_Y病毒攻击后，相对于Flulaval组，4种mRNA-LNP疫苗混合物接种组的小鼠体重减轻更少。
图4四种NA-F2A-HA mRNA-LNP的混合物保护小鼠免受致命剂量病毒攻击
05
四价mRNA疫苗流感的雪貂保护效应
最后，文章又评估了四种mRNA-LNP疫苗混合物在流感典型动物模型—雪貂中的保护效果。正如在小鼠中的表现一样，疫苗接种后在雪貂中引发了强烈抗体反应与中和抗体水平(图5b-5i），且在H1N1、H3N2和IBV_Y病毒的抗原反应上比Flulaval更高。当作者用H1N1毒株A/Hawaii/66/2019攻击雪貂时(图5j)，可以看到在感染的第2/4/7天，有四只接种mRNA-LNP疫苗的雪貂中病毒性RNA适度减少。上述数据展示了，四种mRNA-LNP疫苗组的疫苗反应增强。此外，根据实验结果，文章还表示上述四种mRNA-LNP疫苗不仅引起了对疫苗匹配毒株的强烈反应，而且对异源病毒也产生了更具交叉反应性的抗体谱。
图 5 四种NA-F2A-HA mRNA-LNP疫苗混合物在雪貂中引发保护性免疫
06
结语
近年来基于mRNA的技术进步，使其成为一种实用的疫苗模式。然而，关于抗原组成和表达这些抗原的最佳构型问题仍未得到完美地解决。在这项研究中，作者提出了一种使用双抗原表达mRNA-LNP的策略来改善季节性流感疫苗的接种。仅使用4种混合的mRNA-LNP，通过分离带有弗林蛋白酶和2A切割基序的糖蛋白ORF，完成了共8个单独的NA或HA蛋白的表达。这种NA-F2A-HA mRNA设计可广泛应用于甲型流感和乙型流感病毒糖蛋白，并且可以混合单个mRNA-LNP以实现季节性疫苗的预防广度。同时，与行业标准灭活疫苗Flulaval相比，目前4种mRNA-LNP混合物在小鼠和雪貂中都具有完全的保护性，甚至某些情况下比标准疫苗更优越。此外，文章设计的疫苗混合物对异源病毒也产生了更具交叉反应性的抗体谱。
展望未来，mRNA技术的进步将极大可能改进流感疫苗，最终减轻全球流感的负担。在流感疫苗之外，文章报道的同时递送多种抗原的方法也有可能应用于mRNA递送研究的其他领域，例如癌症、罕见遗传病疗法和其他传染病等。
参考文献
[1] Leonard RA, Burke KN, Spreng RL, et al. Improved influenza vaccine responses after expression of multiple viral glycoproteins from a single mRNA. Nat Commun. 2024 Oct 8;15(1):8712.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice