研究背景：
随着全球糖尿病患者数量的持续增长，约三分之一到五分之一的患者可能发展为慢性难愈合伤口，这严重影响生活质量，亟需更高效的治疗策略。糖尿病伤口愈合受高血糖和相关并发症干扰，导致愈合延迟、血管生成受阻及胶原沉积减少。
目前疗法在应对氧化应激、炎症反应和巨噬细胞衰老等问题上效果有限。牛磺酸因其抗氧化、抗炎特性被认为是潜在治疗剂，而二氧化铈（CeO2）通过动态清除活性氧（ROS）表现出理想特性，两者协同作用有望提升疗效。为克服药物递送障碍，研究提出基于水凝胶微针贴片的系统，提供非侵入性、可控递药方式，促进伤口愈合。
针对上述问题，郑州大学徐冬冬团队将负载牛磺酸的二氧化铈（CeO2@Tau）包裹在明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶中，最终制备了CeO2@Tau@水凝胶@微针（CTH@MN）贴片用于糖尿病伤口治疗（方案1）。CTH@MN在作用于巨噬细胞时，发挥了抗氧化和抗炎作用，并通过激活自噬减缓了细胞衰老。随后，证明恢复免疫稳态的巨噬细胞通过神经修复、细胞迁移和血管再生调控了组织再生，在糖尿病伤口小鼠模型中，CTH@MN打破了氧化-炎症-衰老的恶性循环，恢复了局部伤口的免疫衰老微环境，最终提升了伤口愈合效率。同时，CTH@MN几乎没有副作用，赋予其广泛的临床转化潜力。该文章于2024年10月03日以《Multifunctional Hydrogel Microneedle Patches Modulating Oxi-inflamm-aging for Diabetic Wound Healing》为题发表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202407340）。
研究示意图：多功能 CTH@MN 贴片的制备过程及其促进糖尿病伤口愈合的复杂机制
（1）CeO2@Tau的合成和表征
该团队制备了中空介孔二氧化铈（CeO2），通过透射电子显微镜（TEM）观察（图1a），其表现为规则形态的球形结构，大小均匀且分散良好。能谱分析（EDS）显示CeO2中碳（C）、铈（Ce）和氧（O）的分布特征（图1b）。X射线光电子能谱（XPS）检测验证了CeO2中Ce4+和Ce3+的共存，这与文献报道的一直（图1c）。随后，将CeO2均匀分散在牛磺酸溶液中，经过充分搅拌得到CeO2@Tau，通过紫外-可见光谱分析并确认了牛磺酸成功负载到CeO2上（图1d）。同时，CeO2和CeO2@Tau的平均水合粒径分别为162.86 nm和169.72 nm，电位分别为-16.02 mV和-13.89 mV（图1e, 1f）。CeO2在超氧化物歧化酶（SODase）和过氧化氢酶（CATase）方面展现了优异的模拟活性，这得益于Ce4+和Ce3+离子之间的动态价态互变（图1g）。为了探讨CeO2与牛磺酸结合前后的抗氧化潜力，分别用过氧化氢（H2O2）处理样品，并跟踪反应后H2O2的残余量。结果表明，8小时反应后，牛磺酸的残余H2O2浓度为90.87%，显示其抗氧化效果较弱；而CeO2和CeO2@Tau组的H2O2残余量显著降低，分别为29.47%和20.93%（图1h）。此外，CeO2和CeO2@Tau在清除羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2−）方面也表现出显著的效果（图1i, 1j），这些结果突显了CeO2@Tau卓越的抗氧化特性，表明它是治疗与氧化应激相关疾病的有前景的候选物。进一步通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测评估了CeO2@Tau在不同浓度下对巨噬细胞的细胞毒性，结果表明，当CeO2@Tau的共培养浓度升高至200 µg mL−1时，巨噬细胞的活性仍保持在97.21%，显示出较低的细胞毒性（图1k）。
图1. CeO2@Tau的表征。a) 通过透射电子显微镜（TEM）观察的CeO2的代表性表面形貌图像；b) 通过能谱分析（EDS）测量的CeO2中C、O和Ce元素的含量和分布；c) 通过X射线光电子能谱（XPS）测量的CeO2中Ce的价态特征；d) 通过紫外可见光光谱（UV–vis）测量的牛磺酸（Tau）、CeO2和CeO2@Tau的光学性质；e) CeO2和CeO2@Tau的平均水合粒子尺寸；f) CeO2和CeO2@Tau的Zeta电位；g) CeO2@Tau中Ce3+/Ce4+的价态转变；h) 不同样品在8小时内的H2O2清除效率曲线；i) 不同样品在8小时内的·OH清除效率曲线；j) 不同样品的O2−清除能力；k) 不同浓度的CeO2@Tau与巨噬细胞共培养24小时后的生存率
（2）CTH@MN贴片的制备与表征
研究通过将CeO2@Tau与GelMA水凝胶溶液混合，经过多次真空抽提、干燥、交联固化，并在405 nm紫外光照射下固化，制作出CTH@MN微针贴片（图2a）。微针的20×20阵列排列，显示出其整齐的排列模式（图2b）。通过扫描电子显微镜（SEM）显示了微针尖端的锥形结构，这种结构有助于微针更容易穿透皮肤（图2c）。进一步通过SEM元素映射确认了CeO2@Tau在微针贴片中的均匀分布，确保了药物的持续释放（图2d）。随后研究了CeO2@Tau在PBS和DMEM溶液中的释放性能，CeO2@Tau在30分钟内达到了释放饱和，PBS中的累计释放率为85.2%，DMEM中的为89.8%。这些数据表明该微针贴片在体外具有良好的药物释放特性（图2e）。微针的压缩测试结果表明，微针能够承受超过0.2 N/针的压力而不发生破裂，证明微针具有足够的机械强度，能够有效穿透皮肤，实现药物输送的功能（图2f）。CTH@MN贴片应用于小鼠背部后成功穿透皮肤，并留下清晰且均匀分布的腔隙，渗透效率达到87.3%（图2g）。此外，CTH@MN贴片能够迅速在创伤部位溶解，展示了其良好的吸湿性和生物降解性，进一步增强了其在临床应用中的潜力（图2h）。
图2. CTH@MN贴片的制备与表征。a) CTH@MN贴片系统的详细制备过程；b) CTH@MN贴片外观和形态的高分辨率照片；c) CTH@MN贴片微观结构的扫描电子显微镜（SEM）图像；d) CTH@MN贴片的元素映射图；e) CeO2@Tau从CTH@MN贴片在PBS和DMEM中的释放曲线；f) 不同贴片样品的力-位移曲线；g) 将不同贴片样品插入小鼠背部皮肤后的渗透效率；h) CTH@MN贴片插入小鼠皮肤30分钟前后的明场显微照片
（3）体外抑制巨噬细胞的高炎症状态
为了在体外模拟糖尿病创伤的特征，比较了正常和糖尿病创伤的病理微环境。结果显示，与非糖尿病小鼠相比，糖尿病创伤的ROS水平（图3a,b）、葡萄糖浓度（图3c）和促炎性M1型巨噬细胞比例（图3d）显著增加。在巨噬细胞培养基中加入H2O2（1 mM）和葡萄糖（25 mM）以模拟这些条件后，使用CeO2、牛磺酸和CTH@MN浸提液处理巨噬细胞，观察其炎症表型。流式细胞术结果表明，HG组M1型巨噬细胞比例从对照组的16.3%升至27.2%（图3e），而CTH@MN显著降低这一比例至15.9%，展现协同抗炎作用。基因表达检测（图3f）显示，HG组促炎性细胞因子（IL-1β和IL-6）增加，抗炎因子（IL-4和IL-10）减少，而CTH@MN显著逆转这一趋势。ELISA验证了CTH@MN对促炎刺激的抑制（图3g）。ROS水平评估显示，HG组ROS信号增强，而CTH@MN显著减少ROS至接近对照组水平（图3h）。此外，CTH@MN促进了抗氧化酶SOD1和GPX1的表达（图3i）。Western blotting分析（图3j,k）显示，CTH@MN通过下调NF-κB及其抑制子IκBα的磷酸化水平抑制了NF-κB通路活化。综上，CTH@MN通过调控ROS/NF-κB信号通路发挥抗炎作用（图3l）。
图3. CTH@MN通过抑制ROS/NF-κB通路在体外发挥抗炎作用。正常和糖尿病创伤组织的a) ROS荧光图像、b) ROS水平的定量分析、c) 葡萄糖水平和d) M1型巨噬细胞的比例；e) 经不同处理后的CCR7和CD206标记的巨噬细胞流式细胞术图；f) 不同处理组巨噬细胞中炎症细胞因子的基因表达水平；g) 不同处理组巨噬细胞培养基中炎症细胞因子的水平；h) 不同处理后巨噬细胞中ROS水平；i) 不同处理后巨噬细胞中抗氧化酶基因的表达水平；不同处理后巨噬细胞中NF-κB通路蛋白表达的WB条带（j）及定量结果（k）；l) CTH@MN贴片通过抑制ROS/NF-κB信号通路发挥抗炎作用
（4）通过自噬激活介导的抗衰老活性
基于前述研究，评估了CTH@MN对巨噬细胞抗衰老的潜力。在体外模拟衰老环境下，外源性H2O2和葡萄糖诱导巨噬细胞衰老，结果显示HG组的β-半乳糖苷酶染色显著增强，而CTH@MN处理显著降低了该水平（图4a）。进一步分析发现，HG组细胞周期抑制因子p16INK4A（p16）表达显著上调，CTH@MN处理则有效减少了p16阳性细胞比例，恢复至接近对照组水平（图4b, d）。此外，DNA损伤标志物γ-H2AX在HG组中显著升高，CTH@MN显著降低了其表达，表明DNA损伤减轻（图4c, e）。为了验证CTH@MN的抗衰老机制，与自噬的关系进行了深入研究。自噬体荧光染色（MDC）和流式细胞术结果表明，HG组自噬活性受抑，而CTH@MN处理显著增强了自噬活动（图4f, g），WB结果进一步确认了这一效应（图4h, i）。通过使用自噬抑制剂bafilomycin A1抑制自噬流，发现与CTH@MN组相比，CTH@MN + bafilomycin A1组的衰老巨噬细胞比例显著增加（图4j），证实CTH@MN的抗衰老作用依赖于自噬通路的激活。
图4. CTH@MN通过激活巨噬细胞自噬在体外发挥抗衰老作用。a) 使用β-半乳糖苷酶染色检测不同处理后衰老的巨噬细胞；b) 各处理组巨噬细胞中p16表达的免疫荧光染色代表性图像；c) 各处理组巨噬细胞中γ-H2AX表达的免疫荧光染色代表性图像；d) 巨噬细胞中p16免疫荧光染色的相对定量结果；e) 巨噬细胞中γ-H2AX免疫荧光染色的相对定量结果；f) 使用MDC标记巨噬细胞自噬体后，流式细胞术测量的信号强度；g) 巨噬细胞MDC荧光强度的定量分析；h) 巨噬细胞在不同处理后自噬相关蛋白表达的WB条带；i) 巨噬细胞在不同处理后自噬相关蛋白表达的定量结果；j) 使用巴氟米星A1抑制自噬通路后，巨噬细胞β-半乳糖苷酶染色图像
（5）CTH@MN 启动组织修复相关细胞行为
该研究全面评估了CTH@MN对创伤修复过程中巨噬细胞功能的促进作用。通过将不同处理过的巨噬细胞培养基与新鲜的DMEM混合，制备了巨噬细胞调理培养基（MCM），该定制的MCM被用于神经干细胞（Neuro-2a）、成纤维细胞（L929）和血管内皮细胞（EA.hy926）的培养（图5a）。利用CTH@MN处理的巨噬细胞调理培养基（MCM）培养神经干细胞（Neuro-2a），结果显示，HG组的β3-微管蛋白表达较低，而CTH@MN处理的MCM组则显著提高了β3-微管蛋白的表达，表明CTH@MN能够促进神经分化（图5b, c）。此外，CTH@MN增强了成纤维细胞（L929）的趋化性和迁移能力。在Transwell实验中，HG组的成纤维细胞趋化能力较弱，而CTH@MN组则表现出显著提高的迁移能力，12小时和24小时的迁移率均较其他组更高（图5d, e, f, g），这些结果表明，CTH@MN能够加速成纤维细胞迁移，促进创伤愈合。进一步地，CTH@MN也促进了血管内皮细胞（EA.hy926）的管腔形成，MCM来自CTH@MN处理组的血管内皮细胞显示出更强的增殖活性和管腔形成能力，提示CTH@MN有助于恢复功能性血管网络（图5h, i），这些发现表明，CTH@MN通过其抗炎、抗衰老作用，促进了神经、成纤维细胞和血管内皮细胞的功能，推动了创伤愈合中的组织修复进程。
图5. CTH@MN启动了体外的组织修复行为。a) 巨噬细胞调理培养基的制备与应用示意图；b) 不同处理后Neuro-2a细胞中β3-微管蛋白表达的代表性免疫荧光图像；c) 不同组Neuro-2a细胞中β3-微管蛋白免疫荧光染色的相对定量结果；d) 通过Transwell实验评估不同处理下L929细胞趋化能力的代表性图像；e) 通过Transwell实验测定不同处理组中趋化诱导的L929细胞数量；f) 共同培养0、12和24小时后，刮痕实验的代表性图像；g) 共同培养12小时和24小时后L929细胞的迁移效率，通过刮痕实验测量；h) 不同处理下EA.hy926细胞管腔形成实验的代表性图像；i) 不同处理组EA.hy926细胞形成的管腔数量
（6）CTH@MN促进小鼠糖尿病伤口愈合
鉴于CTH@MN在体外表现出的多重活性，开展了一项糖尿病小鼠创伤模型的体内研究（图6a）。从第0天起，分别用生理盐水、空白微针、CeO2@Tau和CTH@MN治疗，并在第3天重复。创伤的愈合过程通过拍照和面积测量进行评估（图6b）。结果显示，CTH@MN组创面更干净、渗出更少且愈合更快，21天时几乎完全愈合（图6c），优于其他组。
组织学检查表明，CTH@MN显著减少炎症细胞浸润（图6d,h）。二氢乙啶染色显示CTH@MN缓解了创伤组织中的氧化应激（图6e,i）。Masson染色结果显示，CTH@MN组胶原沉积更密集且排列更整齐（图6f,j）。免疫荧光结果表明，CTH@MN显著增强了创伤组织中α-SMA和CD31的表达，促进血管再生（图6g,k）。
ELISA结果进一步验证了CTH@MN的免疫调节作用：显著下调促炎因子IL-1β和IL-6，同时上调抗炎因子IL-10和血管内皮生长因子VEGF（图6l）。这些结果与组织学观察一致，凸显了CTH@MN在加速创伤愈合中的潜力。
图6. CTH@MN促进糖尿病创伤愈合的体内效果。a) 小鼠糖尿病创伤模型的构建、治疗和评估过程的综合示意图；b) 整个治疗过程中小鼠背部创伤的可视化图像；c) 各种治疗组创伤面积的时间进展曲线；d) 第21天小鼠创伤组织的代表性HE染色图像；e) 第21天小鼠创伤组织的ROS染色荧光图像；f) 第21天小鼠创伤组织的Masson染色结果；g) 第21天小鼠创伤组织中CD31表达水平的免疫组化染色图像；h) 第21天HE染色创伤组织中炎症区域的相对定量分析；i) 第21天创伤组织中ROS水平的定量评估；j) 第21天Masson染色创伤组织中胶原沉积的定量分析；k) 第21天创伤组织中CD31表达水平的定量结果；l) 通过ELISA测定的第21天创伤组织中炎性细胞因子的水平
（7）CTH@MN 在体内的免疫调节作用
为了深入探讨CTH@MN促进创伤愈合的免疫学机制，该研究使用流式细胞术分析了创伤组织中巨噬细胞的炎症特征（图7a）。在第7天，CTH@MN组的M1型巨噬细胞比例从对照组的21.7%下降至4.06%，而MN组和CeO2@Tau组的下降幅度较小，分别为16.4%和14.1%（图7b）。值得注意的是，第7天各组之间M2型巨噬细胞比例没有显著变化。然而，在第14天，CTH@MN组M2型巨噬细胞数量显著增加，远高于其他治疗组（图7c）。这些结果表明，CTH@MN能够在创伤愈合初期抑制促炎性巨噬细胞的作用，并促进其向抗炎状态转变。为了验证这一转变过程的分子机制，进一步研究了创伤组织中NF-κB通路的表达。Western blot实验结果显示，CTH@MN在抑制NF-κB通路方面的效果明显优于其他治疗组（图7d,e）。免疫组化染色和定量分析进一步证实了这一点（图7f,j）。此外，CTH@MN处理组创伤组织中的γ-H2AX（图7g,k）和p16（图7h,l）表达显著下调，表明CTH@MN有助于缓解细胞DNA损伤并抑制创伤微环境中的衰老过程。同时，CTH@MN还显著增加了创伤组织中自噬标志物Beclin-1的表达（图7i,m），强调了其在促进细胞自我更新和修复中的作用。
图7. TH@MN在体内的免疫调节活性。a) 第7天和第14天创伤组织中CCR7和CD206标记的巨噬细胞流式细胞图；b) 第7天不同治疗组创伤组织中M1型巨噬细胞的比例；c) 第14天不同治疗组创伤组织中M2型巨噬细胞的比例；d) 第7天不同治疗组创伤组织中NF-κB通路蛋白的Western blot带图；e) 第7天不同治疗组创伤组织中NF-κB通路蛋白的定量分析；f–i) 第7天创伤组织中f) NF-κB、g) γ-H2AX、h) p16和i) Beclin-1表达的代表性免疫组化染色照片；第7天创伤组织中NF-κB（j）、γ-H2AX（k）、p16（l）和Beclin-1（m）的免疫组化染色定量结果
「研究小结」
该团队创新性地将牛磺酸与CeO2纳米颗粒结合，并巧妙地将其包裹在GelMA水凝胶中，制备了CTH@MN贴片系统。该多功能系统在清除ROS、抑制巨噬细胞过度的炎症反应、恢复创伤微环境平衡方面表现出显著的疗效。此外，CTH@MN贴片通过激活自噬并刺激组织再生修复机制，展现了抗衰老特性。
该团队的研究强调了CTH@MN系统在全面调节氧化-炎症-衰老过程中的巨大免疫调节潜力，为其在顽固糖尿病创伤治疗中的应用提供了有希望的前景。
https://doi.org/10.1002/smll.202407340
来源：创赛科研