关 注 我一起学习，一起成长！
Part I
基质胶——常识篇
1
基质胶分类
基质胶主要分为5大类（表1），分别为标准型（Standard）、细胞因子减少型（Growth Factor Reduced, GFR）、高浓度型（High Concentration, HC）、类器官专用型（Organoid）和干细胞专用型（Embryonic Stem Cell, ESC）。
2
应该采购哪一款的基质胶？
2.1标准型基质胶适用于适用于极化细胞的培养，如上皮细胞。促进多种类型细胞的分化，包括肝细胞、神经元、β-胰岛细胞、乳腺上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。例如侵袭实验、成管实验等。
2.2细胞因子减少型基质胶适用要求基质胶成分相对明确的实验，例如类器官培养、血管生成、干细胞培养等。
2.3高浓度型基质胶适用于体内成瘤（CDX、PDX和PDOX）和体内血管生成（Plug Aassay）等。高浓度基质胶成胶速度快，凝胶刚性高，具有更好的支架效果（Cell Scaffold）。
2.4类器官专用型基质胶属于细胞因子减少型亚类，有较高浓度和刚性，且通过小鼠小肠类器官培养测试，能再现小肠类器官出芽表型和分子标志物表达特征。
2.5胚胎干细胞专用型基质胶是经验证具有特定培养基兼容性，且稳定维持干细胞形状和干性的基质胶。
表1基质胶分类和应用场景
3
基质胶保存、解冻、运输和分装？
保存：基质胶通常保存于-20℃的无除霜功能冰箱；
解冻：将基质胶包装瓶半埋于碎冰中，置于2-8℃冰箱过夜；
运输：干冰物流运输；
分装：结合每轮实验基质胶使用量进行分装，分装后于-20℃的无除霜功能冰箱保存，避免反复冻融。
4
使用基质胶前需要试剂和耗材预冷吗？
由于基质胶在高于8℃的环境温度下就会以不可逆形式聚合形成凝胶，所以在操作基质胶过程中，试剂（培养液、稀释液、细胞悬液等）和耗材（吸头、培养皿、EP管和管架等）都要求预冷，冰上操作。
5
基质胶颜色和状态？
冻存状态下，含酚红基质胶颜色通常为浅橘红色，不含酚红基质胶呈现碎冰样白色；解冻后，含酚红基质胶紫红色。解冻后不含酚红高浓度基质胶为半透明浓稠浊液，低浓度基质胶为近乎透明状液体。
6
基质胶出现沉淀怎么办？
如发现基质胶存在少量沉淀，建议4℃低速离心后使用，通常不影响基质胶活性。
7
包被培养皿时，基质胶使用量？
表2基质胶包被培养皿用量指导
Part II
基质胶——实验篇
1
内皮细胞生成实验（Tube Formation Assay）
1.1实验目的
血管形成实验是体外研究血管生成的经典方法，该方法可快速确定调控血管生成的基因、小分子或信号通路，结合钙黄绿素（Calcein）染色和Image J分析工具，可以实现血管生成的定量分析。
1.2实验步骤
1.2.1包被：基质胶解冻后，按照每孔50-60μl的量加入预冷96孔板培养孔中(尽量避免基质胶产生气泡)，并轻轻摇晃培养板，使基质胶均匀铺于培养孔孔底；然后置于37℃细胞培养箱聚合30min。
1.2.2细胞制备：将对数生长期培养中的HUVEC细胞消化，制备成2E+5cell/ml悬液（计数一定要准确）。
1.2.3接种：细胞混匀计数后，将细胞接种至已报备培养孔中，每孔100μl，轻轻摇匀后，置于37℃细胞培养箱继续培养。
1.2.4观察：培养6h（或其他指定时间点）节后，显微镜下观察成管情况，同时采集照片。
1.3 注意事项
1.4.1血管内皮细胞成管实验推荐使用奥格诺德标准型（货号：111105）或细胞因子减少型（货号：121105）基质胶，胶浓度为8-10mg/ml最佳。
1.4.2体外血管形成实验除了选好合适的基质胶之外，内皮细胞的状态也极为关键，建议选择3-5代次的细胞进行实验，铺板接种前注意细胞状态（对数生长期）并进行饥饿培养。同时细胞接种数量不能过稀或者过密。
1.4结果示例
2
侵袭实验（Invasion）
2.1实验目的
细胞侵袭实验是体外模拟细胞主动突破物理屏障发生位置转移能力的一种实验技术，被广泛应用于各种细胞侵袭转移能力探索研究中，结合结晶紫染色可实现定量分析。应用于炎症反应、癌症转移、胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、动脉粥样硬化等研究领域
2.2实验步骤
2.2.1基质胶稀释：基质胶解冻后，将基质胶用无血清培养基稀释至1mg/ml左右，混匀后冰置于上备用。
2.2.2小室铺胶：按照每小室60μl的量将稀释后的基质胶垂直加入预冷小室底部，不要产生气泡，然后置于37℃细胞培养箱孵育2-3h，使基质胶充分聚合为薄膜层。
2.2.3基底膜水化：孵育后将小室中多余液体小心吸掉，加入100μl无血清培养基，然后置于37℃细胞培养箱孵育30min，使基底膜充分水化。
2.2.4检漏：小心吸出小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入下室中，若漏液则可用于下游细胞接种。
2.2.5细胞制备：消化对数生长期待检测细胞，清洗后细胞重悬计数，将细胞浓度调整至1-10E+5cell/ml（根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞密度）；在24孔板下室加入600μl含5%-10%FBS或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取适量细胞悬液（100-200μl）加入上室，最后置于培养箱中培养12-48h（细胞量和时间视细胞侵袭能力变化，结合预实验确定）；同时设置对照孔，下室添加等体积无血清培养基。
2.2.6固定：在指定时间点，取出Transwell小室，去除培养液，用PBS浸湿的棉签或棉花轻轻擦拭小室内基质胶和细胞。在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液，将小室放入固定30min。然后弃固定液，PBS洗涤小室内外1次。
2.2.7结晶紫染色：在24孔板干净的孔中加入600μl结晶紫染色液，将小室放入染色10min。
2.2.8取出小室，PBS洗涤小室内外3次。适当风干后，显微镜下观察定性研究；取3-5个视野拍照后。
2.2.9定量分析：用Image J计数取平均值进行定量研究。
2.3注意事项
2.3.1根据细胞大小选择合适的Transwell chamber小室，常用的为8μm孔径，细胞培养板有6-，12-和24-孔板等，最常用的是24孔板。
2.3.2接种细胞状态和密度非常关键，需结合预实验确定接种数量以及后续检测固定染色时间点。
2.4结果示例
3
皮下成瘤（Xenograft）
3.1 实验目的
皮下成瘤实验为肿瘤发生发展研究和肿瘤药物开发奠定了疾病模型基础，被广发应用于各种肿瘤发病机制研究。高浓度基质胶有效促进肿瘤形成，为肿瘤细胞提供合适的生长微环境。
3.2 实验步骤
3.2.1选取对数生长期的细胞，细胞汇合度达80-90%左右为宜；
3.2.2消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中残余的血清和胰酶。
3.2.3细胞用预冷PBS或无血清培养重悬，计数并根据需求调整细胞密度。细胞悬液与高浓度基质胶1:1混匀。一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/鼠，接种体积为0.1-0.2ml。
3.2.4裸鼠周龄4-6周龄，体重16-18g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋下中后部；
3.2.5从进针部位向前穿刺大约1cm，进行皮下注射，针头在皮下左右滑动几次，以便细胞接种成团，避免注射后细胞悬液从针眼溢出；
3.2.6接种后正常饲养，4-6周成瘤，过程中检测小鼠体重，肿瘤体积变化；最后取瘤进行拍照成像，保存组织用于下游实验检测。
3.3 注意事项
3.3.1细胞与基质胶混匀后，需置于冰上放置，并尽快注射，避免基质胶聚合；同时低温能降低细胞代谢，维持细胞活力。
3.3.2不同细胞成瘤能力也不同，所以细胞接种数量需结合预实验确定最佳值。
3.3.3稀释后的基质胶浓度不可低于4mg/ml。
3.4 结果示例
4
基质胶塞实验（Matrigel Plug Assay）
4.1实验目的
基质胶塞实验是体内探究血管生成的一种技术，可用于分析调控血管生成的基因、小分子或者信号通路，结合病理染色实验能实现血管生成的定性和定量检测。
4.2实验步骤
4.2.1从-20℃把冰箱取出奥格诺德高浓度基质胶，将其半埋于碎冰之中，置于4℃冰箱过夜解冻。
4.2.2将EP管、注射器、针头、吸管等置于4℃或冰上预冷，避免后续基质胶操作过程中提前聚合凝胶。
4.2.3将500μl高浓度基质胶转移至1.5ml EP管中，并添加待测药品（小分子化合物和蛋白等），充分混匀后置于冰上。
4.2.4麻醉小鼠（注射阿佛丁或其他吸入式麻醉）。麻醉后剃毛刀剃出小鼠身体一侧待注射位置毛发，酒精棉擦拭消毒备用。
4.2.5在备皮处进行皮下注射，注射时速度切记不要太快，慢慢推进给药；注射后7-15d形成基质胶塞，并血管化。
4.2.6血管生成实验结束后，麻醉处死小鼠，取出基质胶塞，置于DMEM中，去除基质胶塞表面粘附的其他组织，然后于PBS中再次清洗。
4.2.7图像采集与样本保存：清洗干净后拍照保存，胶塞的红色程度代表血管生成的水平；样本保存后，可以用于病理染色分析血管形成的组织形态。
4.3结果示例
Akhtar N, Dickerson EB, Auerbach R. The sponge/Matrigel angiogenesis assay[J]. Angiogenesis, 2002, 5: 75-80.
5
类器官培养（Organoids）
奥格诺德类器官专用基质胶用于小鼠正常类器官培养
6
干细胞培养（Stem cell）
奥格诺德干细胞专用基质胶用于iPS细胞培养
Tools
都在这里：
SCI母语润色
专注生物医学领域
唯 问 生 物
专注肿瘤基础研究
19901610324同微信
About Us
吉诺生物--微信公众号矩阵
吉诺健康
吉诺生物试剂
吉诺技术服务
吉诺生物--官方网站
吉诺集团
吉诺技术服务