作者|陈凤欣
单位|来宾市兴宾区人民医院医学检验科
—例布鲁氏菌血流感染的病例报道
前言
布鲁氏菌病（brucellosis，简称布病）又称“波状热”，是由布鲁氏菌（Brucella）感染引起的人畜共患传染病，传播途径主要是接触病畜的流产物、分泌物、排泄物及被污染的水、食物等，可经体表皮肤黏膜、消化道、呼吸道感染。现将—例布鲁氏菌血流感染的病例报道如下，并就该菌培养鉴定及治疗等方面内容进行回顾，以供实验室及临床诊治参考。
案例经过
2024年05月27日，患者，女，60岁，反复颈、腰部疼痛3月余，来我院诊治，门诊拟"腰椎间盘突出症”收入院。
入院检查：
查体：T38.8℃，P98次/分，R20次/分，BP104/70mmHg，颈4/5、5/6椎间隙压痛，压头试验阴性，颈椎背伸、左侧弯可诱发疼痛加剧，伴放射至右上肢；腰4/5、5/S1椎间隙压痛。腰椎活动痛性受限，背伸、左、右侧弯均可诱发腰痛。
辅助检查：CT检查:颈椎、腰椎退行性改变；颈3/4、颈5/6椎间盘突出（后中央型）；颈5椎体向后Ⅰ度滑脱；腰4/5椎间盘膨隆并突出（后中央型）；腰1、2椎体压缩性骨折，建议MRI扫描除外新发骨折；腰4、5椎体骨质吸收破坏原因待查。
实验室检查：5月28日血常规：白细胞4.66×10^9/L、中性粒细胞比率68.2%、红细胞3.02×10^12/L↓、血红蛋白85.00g/L↓、血小板计数249.00×10^9/L。C-反应蛋白：60.1mm/L↑、乙肝两对半、传染病三项、血脂、血同型半胱氨酸、心肌酶、随机血糖、肝肾功能、电解质、凝血功能未见明显异常。
根据病史、体征及辅助检查，入院诊断：1、颈、腰部疼痛查因2、神经根型颈椎病3、腰1、2椎体压缩性骨折4、腰4、5椎体骨质吸收破坏查因？
6月2日血培养瓶双瓶需氧瓶报告阳性，培养时间为2.58天，然而革兰染色涂片后镜下未见细菌？是报假阳性吗？
血培养假阳性常见原因：
1、剧烈的温度变化：实验室环境温度剧烈变化造成血培养的生长曲线波动而导致的假阳性。
2、供电电压：电压波动，会导致生长曲线因电压而波动。
3、血培养瓶：血培养瓶过期，培养基底部变色。
4、采血量：血液细胞本身代谢产生CO2，无菌血液在血培养瓶培养时也会产生本地曲线的变化，当采血量过多的时候可能会造成假阳性。
5、白细胞较高：细胞本身代谢产生CO2，可能会造成假阳性。
通过分析血培养假阳性原因，查看血培养报阳曲线平滑，见图1、2。
图1、2血培养报阳曲线
排除电压波动及温度剧烈变化原因，采血量正常，白细胞总数未见升高，血培养假阳性可能性不高，那为什么革兰染色涂片后镜下未见细菌？结合患者有骨质吸收破坏现象，C-反应蛋白：60.1mm/L↑，并有反复发热，血培养2.58天报阳性，考虑布鲁氏菌可能性大。通过查阅文献，柯氏染色方法简单、快速，对布鲁氏菌的鉴定具有特异性高的优点[1]。
立即进行血培养物柯氏染色：找到成堆细小杆菌，形态似布鲁氏菌。见图3。 此时，血培养阳性，涂片未见菌体的原因已找到。微生物实验室立即联系临床报告危急值，并询问医生病人近期是否接触牛、羊等，主管医生追问病史得知，患者3月前有生羊肉接触史。
为进一步确认，刮取血平板上血膜做脲酶试验，12h脲酶试验阳性，见图4。
图3 血培养物及阴性对照大肠埃希菌
图4 脲酶试验阳性柯氏染色
6月03日，血培养瓶转血平板培养24 h,见湿润、灰色、针尖大小的菌落，见图5，加做氧化酶、触酶试验阳性，本实验室无质谱仪，仅能鉴定到属，报告布鲁氏菌某些种。临床予多西环素、利福平口服、庆大霉素肌注治疗，定期复查肝肾功能，续观病情变化。
6月04日血培养瓶转血平板培养48 h，呈圆形、凸起、光滑、较小的灰色菌落，见图6。
图5 血培养瓶转血平板培养24h
图6 血培养瓶转血平板培养48h
6月06日经对因、对症、支持治疗后患者疼痛较前缓解，体温下降，带药出院，出院诊断：颈、腰椎体布鲁氏菌感染。
出院医嘱：1、予多西环素0.1g/次2次/天 、利福平0.15g/次1次/天 口服，连续治疗3月以上；庆大霉素肌注1支、连续5天；2、每月复查肝肾功能1次，避免剧烈运动。
6月12日疾控回报鉴定结果，布鲁氏菌属；布鲁氏菌抗体检测：1:6400。
案例分析
（一）布鲁氏菌革兰染色呈阴性，且着色弱，导致血培养阳性，涂片不易找见菌体导致判断假阴性，柯兹洛夫斯基染色法(简称柯氏染色法) 是鉴定布鲁氏菌的经典染色方法之一，取培养物涂片，固定后进行柯氏染色，布鲁氏菌呈红色球杆状，其他细菌呈蓝色，可用于快速鉴别布鲁氏菌。[1]下面将柯氏染色法的原理及方法分享如下：
柯氏染色法原理：布鲁氏菌对沙黄染料亲和力高，一旦上色就不容易被其他染液复染。因此柯氏染色法首先是采用沙黄染布鲁氏菌，然后再用亚甲基蓝作复染剂染其他细菌及细胞。布鲁氏菌染成红色，其他细菌及细胞染成复染剂所对应的颜色蓝色。
染色方法：染液:革兰染色第四液（沙黄染液）、抗酸染色液第三液（亚甲基蓝染液）
1、为避免布鲁氏菌的交叉感染，疑似布鲁氏菌的涂片要用100％甲醇固定5 min（以杀灭布鲁氏菌）,固定后滴加沙黄溶液，加热至出现蒸汽后，停止加热，保持染色2分钟（注意勿使染液蒸干）；
2、流水冲洗至无色;
3、滴加复染液复染1分钟，水洗，待干，镜检。
注意事项:
1、制备涂片时，如需阴性对照，可将大肠杆菌(ATCC 25922)与待检菌混合涂片再染色。
2、 布鲁氏菌具有传染性，操作的过程中应注意生物安全，制片过程应在生物安全柜里完成。
（二） 血培养仪器阳性报警，在取培养物涂片革兰染色时，最好制两张涂片，如革兰染色未见细菌，可以用其他染色法如瑞氏染色法或柯氏染色法，布鲁氏菌瑞士染色往往镜下可见一堆堆紫色球杆状形似血小板样，仔细辨认可发现菌体大多位于破坏的细胞内。
（三）布鲁氏菌对人有极强的致病性，会引起实验室获得性感染，其中气溶胶是发生感染的主要原因，可通过呼吸道传播，所有标本处理操作均应在生物安全柜内进行。一般不推荐在二级实验室进行布鲁氏菌做体外抗菌药物敏感试验。
案例总结
在血培养涂片检查中，若未能发现细菌存在，不应仓促地判定为假阳性结果。鉴于血培养中可能存在的布鲁氏菌为革兰阴性的细小杆菌，容易与血培养的背景混淆而不易区分，而酵母菌、马尔尼菲篮状菌等微生物，有时菌量相对较少，在涂片检查中不注意观察可能导致漏检。因此，在判断血培养结果是否为假阳性时，需结合患者的其他临床检测数据进行综合分析。
常见的假阳性原因包括血标本在采集或处理过程中受到污染，以及患者体内白细胞计数异常升高等情况。为确保诊断的准确性，建议与临床科室进行深入的沟通，详细了解患者的病史，以明确是否存在病原菌感染的可能途径及高危因素。
在本案例中，最终没有导致误判和漏诊的发生，依赖于检验人员的经验推断和细致的排查工作。这表明，专业知识和丰富经验的累积，以及细致入微和认真负责的工作态度，是实验室诊断工作中不可或缺的素质，也是保证诊断质量的关键因素。
知识拓展
布鲁氏菌病（brucellosis）是一种全球分布的人畜共患病，当布鲁氏菌侵及椎间盘或者椎体组织后导致布鲁氏菌性脊柱炎（Brucella spondylitis，BS），是布鲁氏菌病最常见和最严重的并发症之一，而其中又以腰椎最为常见，即腰椎布鲁氏菌性脊柱炎[2]。脊柱炎、骶髂关节炎。若复发感染，脊椎不稳定，显著的脊椎后突，引起难以控制的疼痛，形成局灶脓肿经抗菌治疗无缓解等情况时建议外科手术。[3]
由于布鲁氏菌为胞内寄生菌，故需用细胞壁穿透力较强的药物。为减少复发和防止耐药菌株的产生，治疗布鲁氏菌需要长时间抗菌药物联合应用。布鲁氏菌复发率相当高，治疗要早期、联合、足量。布鲁氏菌病诊疗方案（2023年版）中抗菌药物治疗方案，见表1、2。[3]
专家点评
点评专家：赵丽 主任技师 广西医学科学院/广西壮族自治区人民医院检验科
布鲁氏菌生长缓慢，血培养涂片革兰染色着色弱不易辨认，基层医院因实验条件限制常出现漏诊或误诊。本文作者能先看血培养的生长曲线排除了常见血培养假阳性，并通过病人的临床症状高度怀疑布鲁氏菌，选择了特异性更强的柯氏染色，且能在鉴定过程中做好相关的防护，保证了实验室生物安全，最后通过流行病史、形态学及快速脲酶试验确诊为布鲁氏菌。作者正是有了相关专业知识的储备，才能在有限的条件对少见菌进行正确的鉴定。
【参考文献】
[1]陈东科,陈丽,许宏涛.柯氏染色法快速鉴别布鲁氏菌的方法学探讨[J].临床检验杂志,2015,33(11):805-807
[2]秦一川 王永峰,原杰,徐朝健,赵斌腰椎布鲁杆菌性脊柱炎的临床诊疗策略[J].中华骨科杂志, 2021,41(20) : 1476-1483[3]布鲁氏菌病诊疗方案（2023年版）[J].中国感染控制杂志,2024,23(05):661-664.
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编辑：李玲 审校：陈雪礼