肝癌是中国第二大致命癌症，也是全球第三大致死癌症。在原发性肝癌中，肝细胞癌（HCC）占所有病例的 80%。肝癌的发病率和死亡率持续上升，构成了重大的全球公共卫生负担。
由于缺乏特异性的症状，大多数 HCC 患者在诊断时已发展至中期和晚期，可能不再适合进行根治性手术切除，这实在令人遗憾。因此，在可治愈阶段及早发现 HCC 对于有效治疗和提高生存率至关重要。
不幸的是，当前的 HCC 诊断策略，无论是血清甲胎蛋白（AFP）检测还是超声检查，都缺乏足够的敏感性和特异性，特别是对于早期 HCC。因此迫切需要开发高度敏感且经济高效的诊断工具，以进一步改善 HCC 患者的预后。
DNA 甲基化异常已被广泛认可为癌症生物标志物。在多种肿瘤类型中均发现导致基因表达失调的 DNA 甲基化变化，从肿瘤发生的早期阶段到整个进展过程都有涉及。值得关注的是，肝脏肿瘤中升高的 DNA 甲基化水平始终能将患者与健康对照区分开来。
基于此，复旦大学附属中山医院樊嘉的研究团队开发了一种基于血液 ctDNA 甲基化信号的肝癌早诊方法 -HepaAiQ。2024 年 5 月，该研究团队在Clinical and Translational Medicine杂志上发表了题为Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicentre cohort study的论文。论文详细介绍了这种用于 HCC 早期筛查和预后评估的监测工具的构建过程和检测效果。研究结果表明，HepaAiQ 能准确地区分肝细胞癌（HCC）患者与慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）患者。更重要的是，HepaAiQ 在巴塞罗那临床肝癌分期（BCLC 分期）的非常早期（0 期）和早期（A 期）的 HCC 患者中显示出良好的诊断敏感性。与 AFP 和 DCP 等常用生物标志物相比，HepaAiQ 展现出更高的诊断准确性。此外，HepaAiQ 还有可能成为评估 HCC 患者治疗疗效和预后的监测工具。
研究方法
研究分 3 个阶段进行：HCC 标志物的发现与优化、HepaAiQ 模型建立与验证，以及 HepaAiQ 的临床应用。
第一阶段，基于公开可获得的和内部的全基因组甲基化数据，选择 HCC 特异性相关的 DNA 甲基化标志物，使用额外的组织样本进行验证，并优化出表现最佳的 20 个标志物，利用这些标志物开发基于血液的多位点定量甲基化特异性 PCR（qMSP）检测——HepaAiQ。
第二阶段，在 559 名患者中建立针对早期 HCC 检测的 HepaAiQ 模型，并在一个包含 523 名患者的队列中进行验证。
第三阶段，将 HepaAiQ 检测方法与现有血清检测方法进行比较；在早期肝癌的独立测试集中应用 HepaAiQ 模型；利用该检测方法对 HCC 患者的预后进行评估。
研究结果
1、HCC 标志物的发现与优化
利用简化甲基化测序（RRBS）方法和 TCGA 数据库获得样本甲基化数据，通过 HCC 肿瘤组织与瘤周组织或健康血浆的三次独立比较，采用P值、甲基化百分位数和GC富集程度对 HCC 组织中高度代表性的差异甲基化区域（DRMs）进行排序，以滤除背景噪声较高的标志物，最后确定了 183 个常见的高甲基化 DRMs。接着用 qMSP 筛选并验证 20 个最有效的标志物，将其纳入多位点 qMSP 分析。
2、构建并验证 HepaAiQ 模型
为了构建用于 HCC 诊断的 HepaAiQ 模型，训练集纳入了一个来自多中心的队列，包含 293 名 HCC 患者、96 名慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）患者、23 名良性肝病（BHL）患者以及 147 名健康对照（HCs）。其中，巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期0/A期（中国肝癌分期I期）的 HCC 患者比例高达 76.5%。所有 559 份血浆样本均采用了 HepaAiQ 检测法进行处理。训练集中所得 HepaAiQ 模型的 AUC（ROC 曲线下面积）为 0.944。
在训练集中，HepaAiQ 模型对 HCC 的敏感性为 86.0%，慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）、良性肝病（BHL）和健康对照（HCs）的特异性分别为 90.6%、100% 和 91.8%。
验证集纳入了 523 名患者，其中 205 名肝细胞癌（HCC）患者，100 名慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC），102 名良性肝病（BHL），116 名健康对照（HCs）。在此队列中，81.5% 的 HCC 患者处于早期阶段（BCLC 分期 0/A 或 CNLC 分期 I）。结果发现，所得 HepaAiQ 模型的 AUC（ROC 曲线下面积）为 0.940，对 HCC 的敏感性为 84.4%，对 CHB/LC、BHL 和 HC 的特异性分别为 88.0%、92.2% 和 90.5%。
值得注意的是，HepaAiQ 模型在训练/验证集中对于早期 HCC 的敏感性分别为 83.0% / 80.8%；对于小于 2 厘米的肿瘤的敏感性分别为 75.6% / 77.8%；对于单个肿瘤的敏感性分别达到 83.9% / 82.9%。这些发现均表明 HepaAiQ 模型在 HCC 早期检测和鉴别诊断方面具有较大的应用潜力。
3、HepaAiQ 模型与传统生物标志物 AFP 和 DCP 的比较
研究人员进一步研究 HepaAiQ 检测法是否在现有的诊断 HCC 的血液检测中展现出更大的临床优势。结果发现，在同时接受了 HepaAiQ 检测和 AFP 检测的 489 名 HCC 患者中，HepaAiQ 检测法展现出更优的诊断性能，其对 HCC 的敏感性为 85.3%，显著高于 AFP(55%)。而在 247 名对照中两者显示出相当的特异性（90.3% VS 88.7%）。重要的是，在 189 名 AFP 检测阴性的早期 HCC 患者中，HepaAiQ 检测法敏感性达到 75.1%。
HepaAiQ 和 AFP 在检测 HCC 中的性能比较。在 489 名 HCC 患者中，HepaAiQ 模型的敏感性在各癌症阶段均显著高于 AFP。
同样地，对 441 名患者使用了另一种 HCC 血液检测方法 DCP 进行了检测。在 232 名 HCC 样本和 209 名对照中观察到了 HepaAiQ 优于 DCP 的表现。值得注意的是，在 56 名 DCP 检测阴性的早期 HCC 患者中，HepaAiQ 发现了 44 名阳性患者（即敏感性为 78.6%）。
这些结果表明，相比于传统的蛋白质标志物，甲基化标志物能更准确地捕捉到 HCC 信号，能提高临床监测的有效性。
4、HepaAiQ 区分高危人群早期 HCC 的独立测试
超声检查结合 AFP 常用于高危人群的 HCC 筛查，为了模拟 HepaAiQ 的实际应用效果，研究纳入了 189 名慢性肝病患者，这些患者要么患有 HCC，要么没有 HCC。
与 AFP 在同一组别的敏感性为 58.5%，和特异性为 92.7% 相比，HepaAiQ 对高风险人群中早期 HCC 的敏感性为 70.8%，特异性为 89.5%。虽然队列规模有限，但HepaAiQ 显示出了在高危人群中进行 HCC 监测的应用潜力。
5、经历过手术切除的 HCC 患者中 HepaAiQ 模型的预后意义
接下来，研究团队在 103 名经历过切除手术的 HCC 患者中探索了 HepaAiQ 模型在预后评估中的潜在用途。在这组患者中，有 47 例在术后随访期间被确认出现肿瘤复发，而 56 例未表现出复发迹象。
结果发现，HepaAiQ 检测的 ctDNA 甲基化水平在 HCC 患者肿瘤切除后一个月显著下降，阳性率从 78.6%（81/103）降至 33.0%（34/103）。进一步分析显示，术后复发的患者在术后 HepaAiQ 检测中的阳性率高于无复发的患者。Kaplan-Meier 生存分析表明，术后 ctDNA 阳性的患者比阴性患者的预后较差（HR，3.33）。单因素和多因素分析均证实术后 HepaAiQ 状态是预测术后复发的独立指标。
结论
研究开发并验证了一种新型的基于血液ctDNA 甲基化信号，用于 HCC 鉴别诊断和预后评估的监测方法——HepaAiQ。且与 AFP 和 DCP 等常用生物标志物相比，HepaAiQ 展现出更高的诊断准确性。HepaAiQ 有望成为一种具有成本效益和简单的 HCC 筛查工具，用于人群水平的 HCC 筛查及患者预后的管理。
参考文献：
[1] Guo DZ, Huang A, Wang YC, Zhou S, Wang H, Xing XL, Zhang SY, Cheng JW, Xie KH, Yang QC, Ma CC, Li Q, Chen Y, Su ZX, Fan J, Liu R, Liu XL, Zhou J, Yang XR. Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicentre cohort study. Clin Transl Med. 2024 May;14(5):e1652. doi: 10.1002/ctm2.1652IF:10.6. PMID: 38741204；PMCID: PMC11091019.