导语
图1. 基于PROTAC的NAMPT降解剂可同时阻断iNAMPT和eNAMPT的致癌功能（来源：J. Med. Chem.）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）是许多酶促反应的辅助因子，也是许多消耗NAD+酶（Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）的底物。烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是NAD+主要合成途径的限速酶。为了维持不可控的生长和增殖，肿瘤细胞比正常细胞更依赖于NAD+水平，这使得肿瘤细胞比正常细胞更容易受到NAMPT抑制剂的影响。基于此原理，很多NAMPT抑制剂被开发，而且有5个NAMPT抑制剂已经进入临床研究。虽然这些化合物在临床前研究中显示出纳摩尔级的细胞毒性，但在临床试验中的抗肿瘤效果并不令人满意。此外，还观察到剂量依赖性毒性，如血小板减少症。近年来研究表明，NAMPT除了以细胞内NAMPT（iNAMPT）这种形式存在外，还可以分泌到细胞外（eNAMPT），作为致癌细胞因子。多项研究报道，eNAMPT可以促进肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成、和肿瘤微环境重塑。因此，eNAMPT已成为一个有希望的治疗靶点。
传统的NAMPT小分子抑制剂之所以在临床实验中效果不佳，主要有以下几个原因：（1）NAMPT抑制剂起初对NAMPT的酶活性有很大的抑制作用，但细胞会进行反馈调节，通过合成更多的蛋白质NAMPT，导致对抑制剂的高需求。（2）传统的酶抑制剂不能拮抗eNAMPT的促肿瘤功能。（3）有严重的血小板减少副作用。因此，迫切需要或开发具有新颖作用机制（MOA）的化合物。
前沿科研成果
基于PROTAC的NAMPT降解剂用于阻断NAMPT的非酶致癌功能
2024年4月30号，广西师范大学梁宏、刘洋汉团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为“Design of FK866-Based Degraders for Blocking the Nonenzymatic Functions of Nicotinamide Phosphoribosyltransferase”的文章。在这篇文章里，作者开发了一系列基于FK866的靶向NAMPT的PROTACs，并确定了LYP-8是一种有效的NAMPT降解剂，它可以同时降低iNAMPT和eNAMPT的表达水平。更重要的是，与临床候选药物FK866相比，LYP-8在小鼠中表现出更优越的疗效和安全性。这项研究强调了将PROTACs作为一种优越的策略来同时干扰NAMPT的酶促功能（iNAMPT）和NAMPT的非酶促功能（eNAMPT）的重要性和可行性，这是传统NAMPT抑制剂难以实现的。
1、NAMPT-PROTAC的合理设计
作者选用抑制剂FK866为NAMPT配体。分析FK866和NAMPT的共晶结构可知：苯环处于溶剂暴露区域（图2A），可以作为Linker连接合适的位点。E3连接酶的配体选用了CRBN配体（Pomalidomide或Lenalidomide）和VHL配体（VHL032）。通过优化不同Linker基团和E3 配体的组合，设计合成了一系列靶向降解NAMPT的PROTACs（如图2B-C所示）。
图2. NAMPT-PROTAC的合理设计（来源：J. Med. Chem.）
2、NAMPT-PROTAC的构效关系研究。
作者共设计合成了37个NAMPT-PROTAC分子。系统研究了linker的长度，linker的种类（烷烃、PEG、含三氮唑、水溶性的构象限制环状），以及不同的E3配体的组合，对NAMPT-PROTAC降解活性的影响。随后作者在SKOV-3细胞中评估了所合成化合物对NAMPT的降解效率，结果表明这些化合物展现出不同的降解特征，具有明显的SAR。其中D-30（LYP-8）和D31（LYP-11）的降解效率最优，在0.5 μM浓度下，对iNAMPT的降解率分别达到了97%和95%。
3、优选化合物LYP-8和LYP-11的浓度依赖降解和时间依赖降解。
鉴于LYP-8和LYP-11在初步Western blotting筛选中展现出来的优秀的降解能力，作者进一步对其进行了广泛的生物学评价。首先是在多种细胞系中进行了浓度依赖的降解实验。LYP-8在SKOV- 3、MKN-45和CT-26细胞中的DC50值分别为26、6.8和520 nM（图3A−C）。LYP-11在SKOV-3、MKN-45和CT-26细胞中表现出等效的iNAMPT降解，DC50值分别为25、6.4和920 nM。这两种化合物都表现出优于阳性对照A7的效果。然后又做了时间依赖的降解实验，表明LYP-8和LYP-11对NAMPT的降解是时间依赖的，在50 nM浓度下，2小时的时候就观察到了降解，在24小时内实现了完全的降解。
图3. 优选化合物LYP-8和LYP-11的对NAMPT的浓度依赖和时间依赖降解（来源：J. Med. Chem.）
4、优选化合物LYP-8和LYP-11的降解机制及对eNAMPT的降解。
此外，作者还验证了LYP-8和LYP-11降解NAMPT是依赖于VHL以及蛋白酶体的，即LYP-8和LYP-11通过与NAMPT和VHL形成三元复合物而诱导NAMPT降解（图4A−C）。
考虑到NAMPT是NAD+合成过程的限速酶，作者在SKOV-3细胞中评价了LYP-8和LYP-11对NAD+水平的影响。结果表明，100 nMLYP-8和LYP-11就能显著抑制NAD+水平，其抑制效果与FK866基本相当（图4D−F）。
鉴于eNAMPT在肿瘤发展多种阶段均发挥了重要功能。作者进一步通过免疫印迹分析评估分泌的eNAMPT水平，在LYP-8处理后eNAMPT显著下降，而FK866处理后，两种细胞系中eNAMPT的表达略有增加而非减少（图4G）。
图4. 优选化合物LYP-8和LYP-11的降解机制和对eNAMPT的降解（来源：J. Med. Chem.）
5、优选化合物LYP-8的药代动力学评价。
作者在大鼠体内对LYP-8进行了PK研究。PK数据（图5）显示其Cmax为147.3 ng mL-1, Tmax为1小时。曲线下面积AUC为919 ng/mL。它具有良好的体积分布（Vz/F = 483.42 L kg-1）和22小时的消除半衰期（T1/2）。值得注意的是，FK866的半衰期（T1/2）约为20分钟。PK研究表明LYP-8是一种适合体内研究的化合物。
图5. 优选化合物LYP-8的药代动力学参数（来源：J. Med. Chem.）
6、优选化合物LYP-8的体内抗肿瘤活性和安全性评价
鉴于eNAMPT在诱导免疫抑制微环境中起着重要作用，因此需要在具有完整免疫系统的小鼠模型中测试化合物。因此，作者利用CT-26荷瘤免疫小鼠模型来评估LYP-8的体内治疗潜力。FK866用做阳性对照。结果表明，相比于对照组，LYP-8能够显著抑制肿瘤体积的增长（图5A）。而且LYP-8在体内也实现了对NAMPT的降解（图5B）。接下来，作者评估了药物治疗小鼠的炎症反应。LYP-8治疗的小鼠显示出较低的促炎细胞因子表达，如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α，TNF-α（图5E）。综上所述表明LYP-8在体内安全有效。
图6. 优选化合物LYP-8的体内安全性、有效性评价（来源：J. Med. Chem.）
总结
总的来说，作者开发了一系列靶向NAMPT的降解剂，其中RPOTACLYP-8综合表现最优。该化合物能够通过PROTAC的作用模式实现对iNAMPT的降解，从而进一步阻断eNAMPT的非酶依赖的致癌功能。而且和已经处于临床二期研究的NAMPT抑制剂FK866相比，LYP-8在体内显示出更有效的肿瘤抑制能力、更好的安全性以及更优秀的药代动力学性质。该研究提供了一种可同时阻断iNAMPT和eNAMPT致癌功能的策略，也进一步体现了PROTAC在靶向癌蛋白非酶依赖的致癌功能的优势。
作者简介
刘洋汉，2009年本科毕业于四川大学。2014年获中国科学院大学药物化学博士学位。2016年8月至2020年7月在美国密歇根大学安娜堡分校药学院做博士后，合作导师是Nouri Neamati教授，现任J. Med. Chem.的副主编。2020年9月入职广西师范大学化学与药学学院。自独立工作以来，近三年（2022-present）已经以通讯作者或第一作者在J. Med. Chem., Eur. J. Med. Chem.等期刊上发表了五篇论文。国家自然科学基金委化学部通讯评审专家。先后获得五项国家级和省级基金项目资助。主要从事“活性先导化合物的发现与结构优化”的药物化学研究。以“基于生物靶点关键氨基酸的合理药物设计”为技术手段，设计合成了多种小分子抑制剂和降解剂。
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