高血压为常见的慢性心血管疾病，是诱发脑梗死、肾衰竭、心肌梗死等疾病的危险因素之一。研究报道天然来源的血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽与人工合成药物相比无副作用且获取来源较广，现已发现玉米、核桃、龙须菜、南瓜籽、辣木叶等都含有ACE抑制肽。
辣木（Moringa oleifera）主要分布在热带与亚热带地区，目前在我国台湾、海南、云南等地均有种植。辣木籽富含蛋白质（37.8%）、油脂、维生素、多糖、矿质元素等营养成分，其食用功能和药用价值使辣木籽成为极具开发前景的食品资源。
云南农业大学食品科学技术学院钟玉旺、徐万莉、王雪峰*等在本实验前期以辣木籽蛋白为原料，通过超声波辅助酶法获得了具有较好ACE抑制率的酶解产物。该研究将以该酶解产物为研究对象，以ACE抑制率为评价指标，通过膜分离技术、强阴离子交换层析分离蛋白肽成分，通过高效液相色谱-串联质谱（HPLCMS/MS）结合生物信息学鉴定筛选出潜在的ACE抑制肽，利用分子对接进一步分析ACE抑制肽的作用机制，解析其二级结构特征及体外活性，旨在为辣木籽降压肽产品或相关功能性食品的开发利用提供理论依据。
01
辣木籽蛋白水解物膜分离组分的活性测定
由图1A可知，酶解液与4 个超滤组分均具有一定的ACE抑制率，在质量浓度为0.25～4 mg/mL范围内，各超滤组分的ACE抑制能力随质量浓度的上升而增强，且相同质量浓度下＜3 kDa的超滤组分具有最高的ACE抑制率，＞10 kDa的超滤组分ACE抑制率最低，由图1B可知，＜3 kDa的超滤组分与其他组分相比，其IC50值更低，可能原因是低分子质量肽组分氨基酸链较短、空间位阻小，更易进入ACE活性口袋而改变ACE的催化活性。
02
强阴离子交换柱层析分离组分活性测定
本研究将分子质量＜3 kDa肽组分在214 nm检测波长下，洗脱体积为70～240、270～320、380～430、590～730 mL的条件下进行检测，分析该组分的洗脱峰个数及其ACE抑制率和IC50值，结果如图2所示。
由图2A可知，从＜3 kDa超滤组分中获得了4 个洗脱峰F-a～d。图2B显示F-a、F-b、F-c组分在质量浓度0.25～4 mg/mL范围内，ACE抑制率随质量浓度的上升而增强，其中以F-b组分的ACE抑制率最高，F-d组分几乎没有活性抑制能力。图2C表明F-b组分的IC50值（0.037 mg/mL）低于F-a和F-c组分，且明显低于＜3 kDa的超滤组分（0.65 mg/mL），说明柱层析分离纯化效果显著。
03
HPLC-MS/MS鉴定
由表2可知，从ACE抑制活性最好的F-b组分中共鉴定到11 条肽序列，利用在线数据 库PeptideRanker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）、Toxin Pred（http://web.expasy.org/protparam/）、Expasy-Compute（https://web.expasy.org/compute）和Pepdraw（http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw） 分别预测了11 条肽的分子质量、溶解性、毒性和疏水性比例。研究表明良好水溶性ACE抑制肽有利于肠道吸收。根据溶解性分析发现QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT具有较好的水溶性，证明它们在水溶液中较稳定，能够被肠道快速吸收，其可能具有较高的ACE抑制率，其二级质谱图如图3所示，化学结构式如图4所示。
04
分子对接
为进一步从鉴定到的3 条肽中筛选出潜在的ACE抑制肽，采用分子对接技术研究QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT（配体）分别与1O8A（受体蛋白）之间的结合模式和结合力，其对接构象图如图5所示。
由表3可知，QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT与1O8A的对接打分值分别为－176.353、－236.175、－174.517。一般受体与配体结合打分值越低，则结合能力越强，表明肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT能与ACE结合。ACE的活性中心由S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520）和S’（Glu162）活性口袋构成，往往活性肽与ACE活性中心残基Trp279、Gln281、His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、Glu411、Asp415、Lys454、Phe457、Lys511、His513、Tyr520、Tyr523形成氢键可以产生高ACE抑制活性，而疏水作用又与两者结合的稳定性密切相关。本研究中，肽QGPRPQ与ACE残基His387、Tyr394、Asp358、Val399、Arg402、Glu403、Tyr360、Tyr523、Glu411、His383可形成10 个氢键，其中对活性位点的关键氨基酸残基Tyr523形成氢键作用力，表明QGPRPQ能与S1活性口袋紧密结合而显示较好的ACE抑制活性。同时QGPRPQ与ACE的14 个氨基酸残基具有疏水作用，则有利于提高复合物的稳定性。另外，肽PPKKKFRTGV与ACE残基Val518、Tyr213、Glu225、Lys118、Val119、Asn66、Asp358、Val399可形成8 个氢键，但未与ACE活性中心的3 个活性口袋形成氢键，表明其ACE抑制活性较差。而肽DPNNFT与ACE残基Tyr360、Ala356、Asn70、Glu143、Leu139、Ser516、Asn66则形成了7 个氢键，其中与活性中心残基Ala356形成了氢键作用力，表明DPNNFT能与S1活性口袋紧密结合形成较好的ACE抑制活性，且可与ACE的7 个残基形成疏水作用。一般来说，活性肽与ACE形成氢键和疏水作用的氨基酸残基数越多，其ACE抑制活性越高，更具结合稳定性。此外，肽段的长度和内部空间结构可能会影响活性口袋中的特征性氨基酸形成氢键和疏水作用。因此，肽QGPRPQ表现出更好的ACE抑制活性和结合稳定性。
为进一步明确肽 QGPRPQ 的体外 ACE 抑制活性，采用固相合成法进行化学合成，该合成肽的HPLC图和一级质谱图如图6所示，测定其IC50值为（1.15±0.3）mmol/L，与以往的研究对比，说明肽QGPRPQ是一种潜在的ACE抑制肽。
05
肽QGPRPQ的二级结构解析
通过PeakFit v4.12软件拟合肽QGPRPQ的原始光谱（图7），在酰胺I带范围内，拟合了7 个子峰。通过对吸收峰面积变化计算蛋白质二级结构相对含量，得出该肽由22.8%α-螺旋、33.3% β-折叠和43.9% β-转角构成。研究发现，通常肽二级结构中β-转角中含有较多的氢键是较有序、规则的结构，表明肽QGPRPQ结构较为稳定。
06
肽QGPRPQ的酶抑制动力学分析
通过Lineweaver-Burk双倒数图探究肽QGPRPQ抑制ACE的动力学模式。如图8和表4所示，
Vmax 和
K
m值都随着抑制肽浓度的增加而降低。研究表明，LineweaverBurk的双倒数作图若随着抑制物浓度的增加，其
Vmax 减小、
K
m增大或减小，则该抑制物的抑制类型属于混合型抑制。另外，混合型ACE抑制肽可以与ACE的活性和非活性位点结合，从而降低了血管紧张素转换酶的催化活性。由此表明，肽QGPRPQ的抑制类型为混合型抑制。
07
肽QGPRPQ对HepG2的抑制作用
采用MTT法测定肽QGPRPQ对HepG2细胞的毒性作用，结果如图9所示。随着肽QGPRPQ质量浓度的增加，HepG2细胞的存活率显示下降趋势；当肽质量浓度低于0.01 mg/mL时，HepG2细胞存活率几乎为100%；而当肽QGPRPQ质量浓度达到0.05 mg/mL以上时，细胞存活率均低于90%，表明肽QGPRPQ已明显抑制了HepG2细胞的增殖。综上所述，肽QGPRPQ在质量浓度低于0.01 mg/mL时，对HepG2细胞无毒性作用。
结论
从辣木籽蛋白酶解产物中分离鉴定到11 条肽序列，其中肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT均具有较好的水溶性，分子对接显示肽QGPRPQ与ACE的S1活性口袋的氨基酸残基紧密结合，与ACE活性中心残基形成氢键和疏水键作用，可以较好地抑制ACE活性，是潜在的ACE抑制肽，其IC50值为（1.15±0.3）mmol/L。该ACE抑制肽的二级结构由α-螺旋（22.8%）、β-折叠（33.3%）和β-转角（43.9%）结构组成，酶抑制模型为混合型抑制，且在质量浓度低于0.01 mg/mL时对HepG2细胞无细胞毒性。本研究为辣木籽蛋白源降压肽的开发利用提供重要的理论参考，但仍需进一步明确不同液体条件下该ACE抑制肽的构效关系，并开展体内降压效果评价。
作者简介
通信作者：
王雪峰，博士、副教授，硕士研究生导师，就职于云南农业大学食品科学技术学院（系主任/专业负责人、硕士点点长、教工支部书记），入选云南省“兴滇英才计划”青年人才、云南省科协青年托举人才，云南省科技特派员、云南省科技项目评审入库专家。近年来主要从事食品蛋白质资源开发、特色畜产品（乳、肉）加工与副产物综合利用的教学与研究工作；主持国家自然基金（2 项）、云南省自然基金（2 项）、云南省农业联合专项重点项目、云南省专家工作站项目、云南省科协青年托举人才项目等各类科研项目16 项，重点参与国家基金、国家重点研发计划项目子课题、云南省重大科技专项、云南省重点研发项目等国家级和省部级科研项目12 项；以第一或通讯作者在国内外学术期刊上发表学术论文50余篇，其中在Food Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Research International、Journal of Dairy Science、International Journal of Biological Macromolecules、Food & Function等上发表SCI论文17 篇（15 篇为中科院1区TOP期刊，ESI高被引论文1 篇）；以第一发明人授权发明专利4 项（国内专利3 项、国际专利1 项）、共同专利权人1 项，获云南省科技进步二等奖1项、中国畜产品加工研究会科技进步奖二等奖1 项。指导学生参加各类科技竞赛项目20余项，其中获国家级竞赛二等奖1 项。
第一作者：
钟玉旺，云南农业大学食品科学技术学院2021级食品加工与安全专业硕士研究生，研究方向为乳制品加工及功能，目前于丽江职业技术学院担任绿色食品生产技术教师。硕士期间在以第一作者在《中国油脂 》、《食品科学 》等学术期刊发表学术论文3 篇。主持/参与云南农业大学科技创新创业项目2 项，参与导师课题2 项，获2022年云南农业大学校级二等学业奖学金，获2022年优秀毕业生。
本文《辣木籽ACE抑制肽的分离纯化、结构鉴定及其体外活性评价》来源于《食品科学》2023年44卷第24期118-126页，作者：钟玉旺, 徐万莉, 范尧珠, 黎依艳, 王雪峰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220926-284。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进未来食品科学的发展，全面践行“大食物观”的指导思想，持续提升食品科技创新和战略安全。由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，北京工商大学食品与健康学院、北京联合大学生物化学工程学院、西华大学食品与生物工程学院、大连民族大学生命科学学院、齐齐哈尔大学食品与生物工程学院、河北科技大学食品与生物学院共同主办， 登赫（上海）生命科学有限公司、北京盈盛恒泰科技有限责任公司、古井集团、嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司、北京三元食品股份有限公司赞助 的“第一届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于 2024年5月16-17日 在 中国 北京 召开。
长按或微信扫码了解详情
为提高我国食品营养与安全科技自主创新和食品科技产业支撑能力，推动食品产业升级，助力‘健康中国’战略，北京食品科学研究院、中国食品杂志社将与湖北省食品科学技术学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物研究所、中南民族大学、湖北省农业科学院、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室、武汉食品化妆品检验所、国家市场监管重点实验室（食用油质量与安全）、环境食品学教育部重点实验室共同举办“第五届食品科学与人类健康国际研讨会”。会议时间：2024年 8月 3—4 日，会议地点：中国 湖北 武汉。
长按或微信扫码了解详情