导读
肠道微生物群的失调被认为与炎症性肠病（IBD）有关。人参皂苷的主要代谢产物人参皂苷化合物K（CK）已被证明是治疗炎症性肠病的有效抗炎剂。然而，CK调节肠道微生物群以改善IBD的机制仍知之甚少。在此，研究发现CK具有调节肠道微生物群抑制促炎细胞因子释放的潜力。补充CK促进了肠道微生物群生态平衡的恢复，主要是通过增加乳杆菌和阿克曼菌的丰度。此外，CK显著提高了来自乳杆菌的色氨酸代谢产物的浓度，这些代谢产物可以激活芳香烃受体。总的来说，CK的缓解作用主要源于促进乳杆菌的生长和色氨酸代谢产物的产生，表明CK可被视为未来治疗IBD的潜在益生元。
论文ID
原名：Ginsenoside CK Alleviates DSS-Induced IBD in Mice by Regulating Tryptophan Metabolism and Activating Aryl Hydrocarbon Receptor via Gut Microbiota Modulation
译名：人参皂苷CK通过调节肠道微生物群调节色氨酸代谢和激活芳香烃受体减轻DSS诱导的小鼠IBD
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：6.1
发表时间：2024.04
通讯作者：范代娣，傅容湛
通讯作者单位：西北大学
实验设计
实验结果
1. CK通过肠道微生物群缓解IBD症状
根据我们之前确定的评估CK减轻IBD的最佳剂量，小鼠连续服用DSS 7天，同时每天服用80 mg/kg体重的CK（图1B）。DSS诱导的IBD小鼠表现出典型的症状，如体重减轻和粪便出血。与模型组相比，补充CK显著减轻了IBD的病理症状，如体重、DAI评分和结肠长度的显著恢复（图1C−F）。此外，组织学分析进一步表明，CK减少了与隐窝破坏和炎症细胞浸润相关的结肠结构破坏（图1G，H）。
为了研究肠道微生物群调节与CK的缓解作用有关的可能性，IBD小鼠和CK处理的IBD小鼠服用了抗生素混合物（图S2A）。当肠道微生物群被抗生素混合物耗尽时，CK不能进一步减轻体重减轻、恢复结肠长度或减少破坏的结肠结构（图1I−L和S2B，C）。因此，这些结果表明，CK可以减轻DSS诱导的IBD症状和结肠损伤，并且保护作用需要肠道微生物群的存在。
图1 CK通过肠道微生物群减轻DSS诱导的实验性IBD。图1B-H是在CK处理的实验中进行的，图1L-I是通过用抗生素抑制肠道微生物群进行的。（A）CK的化学结构。（B）CK处理的示意图（使用BioRender.com创建的图）。（C）CK处理的日体重率。（D）DAI得分。（E）结肠的代表性图像。（F）结肠长度。（G）H&E和PAS染色结肠切片（H）结肠的组织学评分。（I）抗生素处理的每日体重率。（J）抗生素处理结束时的体重。（K）抗生素处理的DAI评分。（L）H&E染色结肠切片。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
2. CK恢复DSS诱导的肠屏障破坏和炎症
维持肠道健康取决于肠道屏障的完整性。根据免疫荧光染色，我们发现IBD小鼠的ZO-1和occludin显著降低（图2A−D）。相反，CK显著增强了黏膜层中这些紧密连接蛋白（TJs）的表达。我们在结肠组织中使用RT-qPCR和蛋白质印迹也获得了类似的结果（图2F−H）。IBD小鼠的血清LPS水平显著升高（图2E），但补充CK后显著降低，表明CK可以降低肠道通透性并恢复肠道屏障。
为了评估炎性细胞因子的水平，我们使用ELISA试剂盒。DSS诱导的小鼠表现出比正常组更高的促炎细胞因子表达，CK处理显著降低了血清中的这些水平（图2I−J）。此外，免疫荧光染色在结肠组织中显示出类似的结果（图S3A−D）。为了证实炎性细胞因子的基因表达，我们评估了IL-1β和IL-6的mRNA表达。CK处理后，DSS-诱导组小鼠结肠中这些促炎细胞因子的水平被降低（图2K）。因此，CK可以修复肠道屏障，有效缓解肠道炎症。
图2 CK在DSS诱导的IBD小鼠中恢复肠道屏障并减轻结肠炎症。（A）occludin的代表性免疫荧光图像。（B）occludin的平均密度。（C）ZO-1的代表性免疫荧光图像。（D）ZO-1的平均密度。（E）小鼠血清LPS水平。（F）occludin和ZO-1蛋白的蛋白质印迹。（G）occludin和ZO-1蛋白水平的定量。（H）Occludin和ZO-1 mRNA水平。血清IL-6（I）和IL-1β（J）水平。（K）IL-6和IL-1β mRNA水平。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
3. CK减轻DSS诱导的肠道微生物群失调
我们通过16S rRNA测序检测肠道微生物群的组成，以分析CK的影响。与模型相比，CK显著增加了Chao1指数、Shannon指数（图3A、B）和ACE指数（图S4A），表明CK可以增强肠道微生物群的多样性。粪便样本中共产生918个操作分类单元（OTU），其中178个为所有组共享（图S4B）。正常组、模型组和对照组的独特OTU数量分别为279个、186个和267个。主坐标分析（PCoA）的结果显示，各组的微生物群组成明显聚类（图3C），样本的层次聚类分析树状图显示，CK组的肠道微生物群组成更接近正常组（图S4C）。这些结果表明CK可以调节肠道微生物群的多样性。
接下来，我们分析了不同水平的肠道微生物群组成，以更详细地了解肠道微生物群的具体变化。模型组拟杆菌门和疣微菌门的相对丰度降低，厚壁菌门和放线菌门的相关丰度增加，而CK处理组小鼠这些菌在门水平上更接近于正常组（图3D−H）。接下来，我们对比了受CK影响的特定属。热图分析表明，CK显著重塑了肠道微生物群的组成（图S4D）。CK显著富集了乳杆菌、阿克曼菌和普雷沃氏菌的丰度，而与模型组中观察到的相比，Turicibacter的丰度降低（图3I−L），呈现出向更健康的方向转变。同样，我们观察到了物种水平的变化，与模型组相比，CK补充也显示出向正常组的明显转变。当给予CK时，Akkermansia_muciniphila和Lactobacillus_apodemi的数量增加，而Clostridium_methylpentosum和Turicibacter_sanguinis的数量下降（图3M，N）。我们采用线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析来区分各组之间相对丰度存在显著差异的生物标志物。LEfSe分类分支图和LDA直方图显示，CK组中阿克曼菌、普雷沃氏菌和乳杆菌（LDA>4.0）富集（图S4E，F），可能有助于缓解IBD。总的来说，这些数据表明CK可以调节肠道微生物群的组成。
图3 CK减轻DSS诱导的IBD小鼠的微生物群失调。alpha多样性分析包括Chao1（A）和Shannon（B）指数。（C）PCoA分析结果。（D）组间微生物群落在门水平上的变化。厚壁菌门（E）、放线菌门（F）、拟杆菌门（G）和疣微菌门（H）的相对丰度。乳杆菌（I）、阿克曼菌（J）、普雷沃氏菌（K）和Turicibacter（L）的相对丰度。（M）组间微生物群落在物种水平上的变化。（N）在物种水平上显著改变的细菌相对丰度。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
4. CK调节DSS诱导的肠道微生物群相关色氨酸代谢紊乱
在营养宿主代谢过程中，肠道微生物群产生大量小分子，并参与许多宿主代谢途径。为了探讨CK是否会引起代谢组学改变，我们对粪便样本进行了非靶向代谢组学分析。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）评分图表明粪便代谢谱中存在明显的分离，置换检验表明模型良好，没有过拟合（图4A−D）。如偏最小二乘判别分析（PLSDA）所示，三组之间的粪便代谢组明显不同，其中我们观察到CK诱导显著的代谢变化（图4E）。与正常组相比，有1272种代谢产物在IBD小鼠中显示出显著变化（图4F），而CK显著逆转了955种代谢产物的变化（图4G）。随后，我们使用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢途径富集分析。如图4H所示，CK富集了与氨基酸代谢相关的途径，尤其是色氨酸代谢显著富集。乳杆菌可以将色氨酸代谢成各种小分子代谢产物，这些代谢产物与IBD的发展有关。因此，我们建立了靶向代谢组学来测量色氨酸代谢产物的丰度。IBD小鼠的N-乙酰-L-色氨酸、5-羟基-L-色胺酸（5-HTP）、3-吲哚丙酸（IPA）、吲哚丙酮酸盐（IPYA）和IA的粪便水平显著低于正常小鼠，而CK组的这些水平显著升高（图4I−M）。这些发现表明，CK可以显著增强IBD小鼠肠道微生物群中产生的色氨酸代谢产物。
IA可以作为色氨酸代谢的生物标志物，在受试者工作特性（ROC）分析中，其曲线下面积（AUC）最大，为0.960（图4N）。随后，我们给IBD小鼠口服IA，以研究CK诱导的色氨酸代谢产物富集在CK抗IBD作用中的关键作用（图5A）。IA显著减轻了IBD症状，如体重恢复、DAI评分降低和结肠缩短所示（图5B−F）。色氨酸代谢产物有效地恢复了结肠的结构完整性和肠道通透性（图5G−I），这表明CK处理的色氨酸代谢产物的富集可以减轻DSS诱导的IBD的病理症状。色氨酸代谢产物也显著增加了组织中TJs的表达（图5J−K和S5A，B），同时组织和血清中IL-6和IL-1β水平降低（图S5C−F）。这些结果表明，CK诱导的IA富集可以有效抑制DSS诱导的结肠炎症，这可能是CK对IBD影响的关键机制。
图4 CK显著富集IBD小鼠的色氨酸代谢产物。（A−D）正常组与模型组、模型组与对照组的OPLS-DA得分图，以及相应的置换检验。（E）PLS-DA评分图，用于区分不同组的粪便代谢组。正常与模型组（F）和对照与模型组的小鼠粪便代谢组学火山图（G）。（H）差异富集代谢物的通路分析。不同组中N-乙酰-L-色氨酸（I）、5-羟基-L-色氨基酸（J）、3-吲哚丙酸（K）、吲哚丙酮酸（L）和吲哚丙烯酸（M）的粪便水平。（N）吲哚丙烯酸的ROC分析。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
图5 CK处理的色氨酸代谢产物的富集减轻了IBD。（A）IA处理示意图（使用BioRender.com创建的图）。（B）每日体重率。（C）给药结束时的体重。（D）DAI得分。（E）结肠的代表性图像。（F）结肠长度。（G）H&E和PAS染色结肠切片。（H）结肠的组织学评分。（I）小鼠血清LPS水平。（J）occludin和ZO-1蛋白的蛋白质印迹。（K）occludin和ZO-1蛋白水平的定量。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
5.CK通过激活微生物群相关的Trp/AhR/IL-22信号通路减轻IBD
RNA测序用于分析结肠基因表达，以探索CK对IBD保护作用的机制。我们发现，与模型组相比，CK组的330个DEG上调，266个DEG下调（图6A）。其中，IBD和CK处理小鼠中差异DEG富集在了与色氨酸代谢、炎症过程和药物代谢酶相关的途径（图6B）。通过调节CYP1A1和IL-22，AhR激活影响炎症性肠病发展过程中的炎症和免疫反应。为了验证AhR激活是否是CK对IBD缓解作用的原因，我们测量了结肠组织中CYP1A1、IL-22和AhR信号蛋白的表达水平。蛋白质印迹研究显示，CK组具有显著更高的AhR、CYP1A1和IL-22表达水平（图6C，D）。在血清中补充CK后，IL-22水平也恢复正常（图6E），这表明CK可以通过激活AhR来调节CYP1A1和IL-22的表达，以减轻IBD。此外，我们通过给予IA也获得了类似的结果。蛋白质印迹分析显示，IA促进AhR信号传导和下游通路蛋白CYP1A1和IL-22的表达（图6F−H）。这些发现表明，CK可以显著富集乳酸杆菌衍生的色氨酸代谢产物，该代谢产物可以通过激活AhR来减轻IBD。
图6 CK激活AhR通路以减轻IBD。（A）CK与模型组之间DEG的火山图。（B）通过KEGG富集分析富集的途径，这些基因在对照组与模型组中通常发生改变。（C）CK处理中AhR、CYP1A1和IL-22蛋白的蛋白质印迹。（D）CK处理中AhR、CYP1A1和IL-22蛋白水平的定量。（E）CK处理后的血清IL-22水平。（F）IA给药中AhR、CYP1A1和IL-22蛋白的蛋白质印迹。（G）IA给药中AhR、CYP1A1和IL-22蛋白水平的定量。（H）IA给药中的血清IL-22水平。不同的字母代表不同的显著差异（P<0.05）。
IBD是一种慢性疾病，通常伴有出血性腹泻等症状。越来越多的临床和实验研究表明，肠道微生物群和色氨酸代谢失调对炎症性肠病的发病至关重要，从而为缓解这种疾病提供了新的潜在途径。虽然先前的研究已经证明CK是一种有效的抗炎天然产物，用于治疗IBD，但CK的作用机制尚未明确。我们的研究提供了证据，证明CK可以通过调节肠道微生物群有效缓解DSS-诱导的IBD。CK可以调节乳杆菌和阿克曼菌的丰度。此外，补充CK显著提高了来源于乳杆菌的色氨酸代谢产物的水平，从而激活AhR并增加肠道屏障。我们观察到CK促进了色氨酸代谢产物的富集，这有助于通过激活AhR信号传导来减轻炎症，这表明CK通过调节微生物代谢产物发挥抗IBD作用。
图7 CK减轻DSS诱导的小鼠IBD的机制（图由BioRender.com创建）
肠道微生物群失调对IBD的进展至关重要。我们使用了一个小鼠模型，在该模型中，肠道微生物群通过抗生素处理而耗尽，以评估肠道微生物群的功能。研究结果证实，CK可以通过肠道微生物群的积极功能调节来改善IBD的病理症状。IBD患者的肠道微生物群组成经常发生显著变化，从而加速疾病的进程。在此，我们的研究结果表明，CK组中阿克曼菌和乳杆菌的丰度上调，据报道，在IBD患者中，这两种菌的丰度显著失调。最新研究表明，益生菌可能有望治疗或减缓IBD的进程。嗜黏蛋白阿克曼菌已被证明对肠道炎症有益处。已经证明，乳杆菌有助于调节小鼠的肠道微生物群失调，以减少肥胖。此外，乳杆菌可以产生多种色氨酸衍生的分解代谢产物，这些分解代谢产物可以激活AhR并增强自身免疫，从而在代谢组和免疫库中产生显著变化。这些发现强调了CK处理的IBD小鼠肠道微生物群的重要性。
IBD的发展一直与肠道微生物群有关，而潜在的细胞或分子因素仍知之甚少。越来越多的证据表明，代谢物在介导宿主-微生物相互作用中至关重要，并在微生物群落中充当重要的信号分子。例如，微生物衍生的SCFA已被证明具有优越的抗炎作用，并有助于在IBD模型中保持结肠屏障的完整性。微生物色氨酸代谢产物（包括IAA、IA和IPA）有可能通过刺激抗炎细胞因子的表达，对炎症性肠病的进展产生不同的影响。粪便代谢产物的途径富集分析确定，乳杆菌产生的色氨酸代谢在CK的缓解作用中起着重要作用。据报道，色氨酸代谢通过使宿主细胞和肠道细菌产生活性最终产物来保持肠道稳态。我们的数据表明，CK显著恢复了IBD小鼠中微生物色氨酸衍生物（吲哚衍生物，包括5-HTP、IPYA、IPA和IA）的水平。色氨酸代谢途径可以产生IA和IPA，这两种色氨酸代谢物被认为会影响肠道通透性和宿主免疫反应。我们确定IA是CK处理小鼠的一种关键指示代谢产物。此外，我们发现IA可以防止肠上皮屏障的破坏，在改善DSS诱导的IBD方面表现出与CK相似的作用，这表明CK可能通过微生物色氨酸代谢产物发挥其抗IBD作用。有文献表明，这些代谢产物通过色氨酸AhR途径控制肠道稳态。
AhR广泛表达，对IBD的治疗至关重要。饮食中摄入AhR配体可以通过参与肠道内的抗炎和解毒途径来维持肠道健康。AhR信号调节的一个关键方面涉及药物代谢CYP酶的自动调节反馈。因此，微生物群衍生的AhR配体可以为IBD提供一种潜在治疗方法。转录分析表明，CK可能通过激活AhR和药物代谢CYP酶发挥抗IBD作用。我们推测CK可能调节肠道微生物群——色氨酸代谢产物——AhR轴以减轻IBD。重要的是，我们的研究结果表明，CK激活了AhR并上调了CYP1A1的表达，导致IBD小鼠结肠组织中IL-22的表达增加，这为我们的结果提供了令人信服的证据。
结论
总之，我们的研究结果表明，CK有可能以肠道微生物群依赖的方式显著缓解IBD症状。CK可以缓解IBD小鼠的微生物失衡，恢复肠道屏障功能，并显著丰富乳杆菌衍生的色氨酸代谢产物的产生。用富含肌酸激酶的色氨酸代谢产物（IA）补充IBD小鼠，通过激活AhR恢复肠道屏障并减轻炎症（图7）。因此，我们的研究结果表明，CK对IBD具有一种新的生化机制，为未来的研究和开发具有缓解IBD潜力的新CK衍生成分提供了至关重要的基础。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38602268/
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