食品安全是重要的民生问题。随着生活水平的提高，人们对于食品安全的要求和关注程度越来越高，而食品安全检测是确保食品卫生安全的关键，也是提升食品质量安全的重要环节。随着对纳米材料的研究不断深入，利用纳米材料的优异特性提高食品安全检测稳定性、灵敏度、多重性，降低成本以及定量检测逐渐成为该领域内的研究热点，其中二维纳米材料在食品安全检测技术领域的应用取得了优良成果。
二维纳米材料是当前纳米材料研究领域的热点之一。自2004年石墨烯的问世，二维层状纳米材料的制备和应用也随之发展，与其他维度的纳米材料相比，二维纳米材料具有更高的比表面积，良好的导热性、导电性、催化活性和生物相容性等优良特点，目前广泛应用于生物医学、电化学、食品检测等领域。华南农业大学食品学院的李景敏、罗 林*、广东第二师范学院生物与食品工程学院的贾宝珠等人重点介绍了二维纳米材料的特点及其在食品安全检测中的最新应用，为保障食品安全提供相应参考。
01
二维纳米材料概述
1.1 二维纳米材料的分类
二维纳米材料是指电子仅在两个维度的纳米尺度上自由运动的一大类材料的总称，是将一维局限于单原子层的层状纳米材料，包括单层和多层纳米材料。
1.1.1 石墨烯
石墨烯是一种二维碳纳米材料的衍生物片状材料，其主要结构是由sp 2 杂化碳原子组成的六元环相邻连接而形成的二维单原子层厚度的蜂窝状晶格结构，sp 2 杂化碳原子之间构成的σ键化学键键能较高，碳原子p轨道剩余的一个电子共同构成大π键，电子可以在石墨烯面上自由移动，因此展现出了机械、电气、热学、光学和电子特性等优越性能。但是这些突出的特征只在单层无缺陷石墨烯层中可以观察到，这大大限制了石墨烯在实际应用中的适应性。石墨烯在与其他纳米材料结合形成纳米复合材料后其适用性得到很好的改善；同时，还原氧化石墨烯（rGO）也为构建灵敏、特异性的生物传感提供了新的可能。
1.1.2 石墨炔
石墨炔是一种具有sp和sp 2 杂化碳原子稳定共存的二维平面结构的纳米材料，2010年首次通过交叉偶联反应的方式合成，由于石墨炔独特的物理化学性能，其在传感领域具有广阔的应用前景。石墨烯在传感器中的应用有助于构建先进检测系统、放大检测信号，最终实现快速灵敏检测目标物。Wang Tao等采用水热法制备了钯-铁纳米材料修饰的石墨二炔纳米片，该复合材料能有效地催化过氧化氢分解生成·OH，能通过消耗谷胱甘肽（GSH）同时实现GSH的检测和细菌消杀，在临床诊断以及食品安全检测方面具有重要意义。
1.1.3 二维过渡金属碳/氮化物
MXene材料是继石墨烯之后对其基础研究最迅速的热点材料之一，其主要采用化学蚀刻的方法蚀刻掉前驱体MAX相中的A原子层而得。Naguib等用浓氢氟酸选择性刻蚀Ti 3 AlC 2 中Al原子层的方式首次合成了Ti 3 C 2 纳米片状的MXene材料。与其他二维纳米材料相比，MXene材料是唯一兼具导电性和亲水性的二维纳米材料，还具有丰富的表面功能基团和高度的功能化潜力，在生物医学、能源储存与转换、水体净化、化学电容器和催化等领域表现出良好的性能。同时，由于MXene具有金属导电性和二维层状原子结构，在传感器领域作为化学修饰电极的修饰材料，可以用于生物分子或气体分子的灵敏检测。
1.1.4 二维金属有机框架
MOFs是一种由金属节点和有机配体连接而成的结晶多孔聚合物，由于其高比表面积、高孔隙率、合适的尺寸和良好的生物相容性等性质备受关注，在气体分离分析、能量储存、催化和生物传感等方面有广泛的应用；大多数基于MOF材料构建的生物传感器的检测机理主要依赖于它们的光学、催化、电化学等性质。Song Yingpan等开发的基于半导体有机金属框架的电化学适配体传感器可以灵敏检测食品中恩诺沙星的残留；此外，随着MOFs材料合成技术的快速发展，由于其结构多样、孔隙高度有序、结构性能可调和丰富的活性位点等优越性能在传感领域应用更广泛。
1.1.5 二维过渡金属二硫化物
TMDs是一种带隙可调的类石墨烯材料，最具代表性的为二硫化钨（WS 2 ）和二硫化钼（MoS 2 ）。TMDs的合成方法大致可分为自上而下和自下而上两种，合成方法的选择主要取决于合成的简易性、材料的类型和应用。TMDs除了具有石墨烯的优越性能之外，层状的TMDs由于其有一个从间接带隙到直接带隙的转变，主体材料被缩小到单层，从而产生了独特的光学和电学性质，使其成为各种光电子器件的理想材料。另外，层状的TMDs由于丰富的活性中心和高比表面积而表现出良好的催化性能，近年来已成功地用于食品有害物质的电化学检测。
1.1.6 二维过渡金属氧化物
TMOs主要包括锰、钴、镍、铜、锌等过渡金属的氧化物，由于其优异的物理化学特性和丰富的自然储备而引起广泛关注，越来越多的学者致力于合成TMOs材料并通过控制其微观结构以提升材料的性能。先前报道的超薄金属氧化物纳米片的合成方法大多数是利用石墨烯氧化物（GO）作为模板合成，Sun Ziqi等通过大量实验证明了通过自下而上合成超薄2D TMOs的方法对于制备具有高比表面积、高化学活性和量子限制效应的各种功能纳米结构具有重要意义。Tan Jingying等通过简单的水热法合成了Co3O4纳米片，利用其催化活性的特征构建了一种用于H 2 O 2 和葡萄糖检测的比色和荧光双检测模式光化学传感器，这种传感策略将促进Co 3 O 4 纳米片在生物医学诊断和食品分析领域的应用。
1.1.7 黑磷纳米片
BPNs是一种超越石墨烯电化学性质的优异类石墨烯纳米材料，具有直接带隙可调、载流子迁移率高、氧化还原电位低等优良的结构和电化学性质，引起了研究学者极大的兴趣。与其他二维纳米材料相比，BP Ns制备困难、循环过程中体积膨胀大、电子导电性差，导致其实用性一直较低。作为备受欢迎的光热材料之一，BP Ns还具有较大的消光系数和较高的光热转换效率，可以实现良好的光热效应。Zhang Yi等利用BP Ns的光热特性，制备了17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）抗体修饰的BPs-金复合材料作为光热信号探针，建立了一种测定E2的超灵敏光热侧向流动免疫分析方法，其灵敏度为目视荧光分析的100 倍以上，推动了BP Ns在快速检测方法中的应用。
1.2 二维纳米材料与食品安全检测相关的特性
近年来，凭借二维纳米材料的大比表面积，易修饰，良好的类酶催化活性、光热特性、荧光特性以及导电性等优势，研究人员开发设计了许多基于二维纳米材料的生物传感器，用于检测食品有害物质。二维纳米材料与食品安全检测相关的特性主要包括：1）大比表面积及易于修饰的特性可使二维纳米材料作为载体在生物传感器中可有效固定抗体、适配体、酶等生物分子及信号分子，实现对目标分析物高灵敏、高选择性地识别与测定；2）二维纳米材料的类酶催化活性，使其可作为天然酶的替代品用于生物传感器的信号转导，有望降低检测成本、提升传感器的稳定性；3）自身的发光特性或荧光猝灭能力，能使二维纳米材料作为荧光传感器的荧光信号来源或荧光猝灭剂，用于构建低背景干扰、高灵敏响应的荧光传感器；4）二维纳米材料的导电性与快速电子转移能力使其成为优异的电极修饰材料，放大电化学传感器检测信号，提升检测灵敏度；5）部分二维纳米材料，可用于制备光热传感探针，与其他信号检测模式结合构建多模式传感器，利用各模式间的相互校准效应提升检测的准确性与可靠性。
02
二维纳米材料在食品安全检测中的应用
2.1 有机污染物检测
有机污染物的残留对人体的危害一直以来都是食品安全问题的关注焦点，包括农兽药的残留、环境污染以及加工过程中的有机污染物。近年来，许多研究学者基于各种新型二维纳米材料为食品中有机污染物的检测设计了许多新的方法（表1）。Chen Yaqian等制备了具有高催化活性的二硫化钒纳米片（VS 2 Ns）纳米酶（图1A），该纳米酶可以作为抗体标记的优良载体，有效固定E2单克隆抗体并建立双信号横向流动免疫分析检测E2。Xiang Yuan等基于优异电催化活性的二维层状黑磷开发的纳米传感器已成功应用于葡萄汁和红葡萄酒样品中赭曲霉毒素A（OTA）的简单伏安法检测（图1B）。为了进一步提高二维纳米材料在检测方面的性能，学者们致力于复合二维纳米材料的研究。Zhao Fengnian等以超薄MXene纳米片为天然还原剂和载体，在超薄的MXene纳米片表面通过自还原反应合成Au-Pd双金属纳米颗粒（图1C）。除此之外，复合二维纳米材料在荧光检测方式上也有较大的应用前景。Chen Yao等研究合成了Cu 2+ -g-C 3 N 4 纳米材料，基于Cu 2+ 在纳米碳氮化碳、乙酰胆碱（ATCh）和AChE之间的竞争络合作用，开发了荧光比色双响应传感器（图1D），该传感器能快速、灵敏地检测马拉硫磷。他们同时对比了比色探针的检测效果，证明基于Cu 2+ -g-C 3 N 4 纳米材料的双响应探针有更宽的检测范围，具有较高的灵敏度和可信度。随着二维纳米材料在生物传感器技术中的应用和发展，生物传感器检测技术在有机污染物检测中呈现出巨大优势，各种聚合物与纳米材料结合形成的二维复合纳米材料解决了二维纳米材料的部分局限性。
2.2 食品添加剂检测
二维纳米材料在食品添加剂的检测中发挥着重要作用。Zhang Haizhi等研究了基于D-氨基酸氧化酶（DAAO）和二维金属有机骨架纳米片介导的级联酶反应建立的食品中苯甲酸钠（SB）的快速比色检测方法（图2A）。其利用二维MOF纳米酶的类过氧化物酶催化活性构建的比色体系实现了对果汁、葡萄酒和食醋中苯甲酸钠的灵敏检测。Yang Yi等成功制备了MoS 2 纳米片和纳米镍片复合修饰的玻碳电极（Ni/MoS 2 电极），研究了Ni/MoS 2 的电化学特性及其对亚硝酸盐的响应（图2B），镍纳米片均匀地覆盖在二硫化钼纳米片的表面，提高了导电性能。在优化条件下制备的Ni/MoS 2 电极具有良好的检测性能和稳定性。如图2C所示，Zhang Luwei等建立了一种基于MnO 2 纳米片-3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）-GSH作为氧化传感体系（MnO 2 -TMB-GSH）快速检测偶氮二甲酰胺（ADA）的比色方法。二维纳米材料还可以与分子印迹技术以及电化学分析技术相结合，Yue Xiaoyue等利用贵金属颗粒/电化学还原氧化石墨烯的方法制备了原位组装分子印迹聚合物传感器并用于选择性和灵敏性地检测叔丁基对苯二酚（TBHQ），在食用油样品叔丁基甲苯的检测中具有良好的重现性。
2.3 食源性致病菌检测
目前，许多研究学者致力于开发设计食源性致病菌检测的新方法，其中基于各种新型二维纳米材料的优异特性研制的检测方法如表2所示。Singh等报道了一种二维纳米材料与微流控芯片相结合的检测方法，其采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）铺助化学剥离法制备了功能化的MoS 2 纳米片，将其作为传感器材料与芯片集成，利用电化学阻抗技术（EIS）对鼠伤寒沙门氏菌细胞进行检测（图3A）。针对沙门氏菌的检测，Feng Kaiwen等还构建了一种基于CoFe-MOFs-石墨烯纳米复合材料的新型电化学免疫传感器，用于检测牛奶中的沙门氏菌（图3B）。如图3C所示，Wang Sihan等成功研制了一种新型的以金属-有机骨架（Mn-MOF-74）为阻抗探针的免疫传感器，通过与免疫磁分离方法相结合，形成了双抗夹心检测模型，用于快速检测单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L.m）。该检测模型不仅具有较高的分离富集率和对L.m的超灵敏定量检测，也可用于其他食源性致病菌的检测。Hu Wenchao报道了二维金属-有机骨架纳米酶的电化学检测器（图3D），其利用含有万古霉素和Ab2抗体的双重识别方法，在两个不同的位置特异性识别金黄色葡萄球菌，二维MOF纳米酶对不同的pH值和温度具有良好的催化稳定性。
2.4 重金属检测
目前，二维纳米材料介导的各类检测方式已成功应用于Hg 2+ 、Cd 2+ 、Pb 2+ 、Ag + 和Mn 2+ 等金属离子的检测。Desai等报道了超小二维MXene纳米片用于选择性灵敏检测Ag + 和Mn 2+ ，在384 nm激发波长下，Ti 3 C 2 NSs在461 nm处表现出最高发射荧光强度，Ag + 和Mn 2+ 与Ti 3 C 2 NSs表面发生强烈的相互作用，使Ti 3 C 2 NSs的荧光猝灭。Chen Guozhen等报道了一种基于2D-MOFs纳米片无标签的铅离子双模式检测（图4A），通过自来水和肥料样品中铅离子的成功检测验证了双峰机制的适应性，并通过电感耦合等离子体分析验证了方法的准确性。除了荧光检测方式之外，Kong Lulu等采用简单的一步法合成了超薄二维钯纳米片（Pd Ns），通过比色法检测Hg 2+ 的LOD达到0.55 ng/mL（图4B）。
03
结 语
二维纳米材料作为一种生物传感纳米材料的研究取得了前所未有的进展，给食品安全检测技术研究领域带来了新的机遇，在酶联免疫分析、生物传感器、电化学检测、光学免疫分析等检测技术中具有放大检测信号、提高灵敏度和选择性以及缩短检测明间的作用，但在实际应用中仍有重大挑战。基于二维纳米材料的食品检测技术进行目标物检测仍存在一定的局限性，比如在单一的二维纳米材料上修饰酶、抗体、适配体、核酸等生物分子明，尽管具有高比表面积，但其表面活性官能团相对较少，修饰过程复杂，不适合进一步功能化，因此面临着与抗体、酶等生物分子结合困难、检测稳定性差以及纳米材料与抗体相互影响的挑战。此外，基于二维纳米材料的传感器在检测明受环境参数、需要大型设备、成本高等因素影响，二维纳米材料在食品安全检测中的应用未开发商业化产品，大多数应用仍停留在实验室研究阶段，弥合实验室研究和实际应用之间的差距是未来研究的焦点。二维纳米材料的表面功能化、导电性等性能受物相、结晶度、剥落程度、稳定性和尺寸等特征影响，受制于材料的合成方式。另外，二维纳米材料的毒性也制约其在食品检测技术中的发展，如采用氢氟酸刻蚀的MXene材料有一定的毒性，且会造成环境污染，大多数二维纳米材料的生物安全性也尚未得到验证，提高二维纳米材料特性、消除或降低自身毒性仍是未来需要努力的方向。
通讯作者：
罗林副教授
华南农业大学食品学院食品科学系
硕士生导师。担任《Frontiers in Chemistry》评审编辑（review editor）、 《Foods》客座编辑、《Frontiers in Sustainable Food Systems》客座编辑。主要从事食品质量与安全快速检测技术研究与应用，重点关注小分子免疫分析中半抗原及信号标记材料设计合成、抗体与小分子半抗原识别机制研究，免疫分析新型信号放大策略开发，并由此开发小分子污染物的高质量抗原、抗体核心原材料，以构建快速、简便、准确、高灵敏的免疫分析方法并开发相应快速检测产品。近五年以第一作者或通讯作者在J. Hazard. Mater、 J. Agric. Food Chem、Food Chem、 Food Control、Sens. Actuators, B、Anal. Chim. Acta、食品科学等期刊上以发表论文20余篇；获发明专利授权10余项。主持十三五国家重点研发计划子课题2项、国家自然科学基金青年基金1项，广东省自然科学基金2项，参与国家自然科学基金，广东省重点研发计划，广州市科技计划重点专项等项目多项。获2022年度中国食品工业协会科学技术一等奖1项。
第一作者：
李景敏硕士研究生
华南农业大学食品学院
研究方向为食品安全快速检测。参与水产品中鱼类麻醉剂残留测定的纳米酶免疫分析技术研究，麻痹性贝类毒素绿色智能化免疫分析方法研究，水产品中渔用麻醉剂智能化检测技术研究与应用等多项科研项目，本科期间发表核心期刊2篇，申请专利一项，获得特等奖学金、优秀毕业生、江苏省优秀毕业论文等荣誉。硕士期间两次获得硕士学业奖学金一等奖，发表EI论文2篇，申请专利一项。
本文《二维纳米材料在食品安全检测中的研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷23期353-364页. 作者：李景敏，贾宝珠，詹蓉蓉，唐飞燕，黄惠晶，邓浩，徐振林，罗林. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221114-160. 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
大曲作为糖化发酵剂，为白酒酿造提供了重要且丰富的菌系、酶系和物系，即为后续窖内酒醅发酵提供微生物，将原料降解成小分子物质的水解酶或催化酯类物质合成的酯化酶，以及白酒风味物质或其前体物。大曲生产过程通常包括1 个月左右的主发酵期和2～6 个月左右的贮存期。在主发酵期，来自于制曲原料及环境的微生物生长代谢，通过开关门窗、揭盖草帘进行工艺调控，其间，温度、湿度等不断变化，微生物菌群发生演替，同时积累了丰富的酶系以及风味物质。而在贮存期，大曲大多是在自然条件下堆积存放，期间水分、酸度和淀粉的变化相对稳定，初级、次级代谢过程以及各种微生物和代谢物发生复杂变化。目前对大曲质量的判断主要依赖于长期积累的生产经验和部分理化性质，这使得大曲的生产质量充满不稳定性。近年来，关于大曲主发酵期间微生物群落及功能变化机制的研究非常活跃，而贮存期大曲微生物群落结构、酶系以及风味物质变化也越来越受到关注。Fan Guangsen等通过高通量测序技术发现大曲在通风良好、干燥的贮存环境中微生物会进一步相互作用，达到优化微生物群落的效果，同时发现清香型大曲经贮存后酯化力和发酵力增加，而液化力和糖化力变化不大。He Muwen等采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术测定贮存期大曲挥发性代谢产物，发现风味物质种类逐渐积累，在贮存3 个月含量达到最高，而Zhang Yuandi等发现贮存使挥发性化合物的种类和含量有所下降。总之，现有研究显示贮存过程对大曲质量具有重要影响，但关于贮存期大曲微生物群落结构及代谢产物变化机制的研究鲜有报道。
对于微生物群落的演替机制，人们广泛认可随机性过程和确定性过程同时影响菌群的组装过程。Tan Yuwei等采用构建零模型的方法评估了白酒发酵过程中微生物群落的组装模式，结果显示微生物群落的演替既受确定性因素（温度、有机酸和乙醇）的驱动，也受随机性过程的驱动。Xu Min等发现微生物的生态位差异也影响着群落的构建过程。大曲代谢物的变化被发现与微生物群落的演替紧密相关。Gan Shuheng等通过宏基因组测序获得了糖化力、液化力与杆菌纲、曲霉属、罗山松属和散囊菌目间的正相关关系。He Muwen等采用相关性网络分析挥发性化合物与微生物之间的关联，结果显示，曲霉属、根毛霉属、芽孢杆菌属、横梗霉属与酯类的形成呈正相关。
对于固态发酵基质而言，热量、水和氧气难以传递，Zhang Yuandi等发现同一块大曲不同部位的微生物群和挥发性物质具有不同的分布特征，因此大曲曲心和曲皮的微生物生长代谢存在差异。四川轻化工大学生物工程学院的徐千惠，罗惠波，黄丹*等通过高通量测序解析浓香型大曲的曲心和曲皮在贮存期间发生的微生物群落结构变化，并分析糖化酶、液化酶活力的变化，利用HS-SPME-GC-MS研究挥发性代谢产物的差异，构建零模型解析微生物群落的组装过程，运用相关性分析探究糖化力、液化力、风味物质与大曲微生物之间的联系，揭示浓香型大曲贮存期菌系、酶系以及物系的变化机制，为优化大曲贮存工艺、提高大曲质量提供理论依据。
1 浓香型大曲贮存过程中微生物群落结构变化
1.1 浓香型大曲贮存过程中优势微生物群落演替特征大曲微生物在持续进行的贮存过程中此消彼长，采用高通量测序对其演替情况进行解析。
在大曲贮存期间共注释到16 个细菌门和4 个真菌门，212 个细菌属和30 个真菌属，其中将平均相对丰度前10的优势微生物属变化情况绘制成柱形图展示。由图1a可知，曲皮在入库贮存第0天的主要优势细菌是芽孢杆菌属（
Bacillus）（23.69%）、假单胞菌属（
Pseudomonas）（26.58%）、魏斯氏菌属（
Weissella）（20.94%）等，这种优势地位到了贮存第43天被链球菌属（
Streptococcus）（33.31%）、放线菌属（
Actinomyces）（18.83%）取代。贮存第43～108天，魏斯氏菌属迅速生长成为绝对优势细菌（1.41%～63.08%）。贮存第108天和第161天的曲皮细菌组成较为相似，这与唐贤华等得出的贮存期导致大曲微生物种类趋于平稳的研究结论一致。并且有研究结果可以解释这一现象：贮存过程中温度、水分、酸度等环境条件的变化会导致大曲微生物之间进一步相互作用，使群落结构趋于相似，最终形成一种稳定体系。而在曲心，贮存前43 d的细菌组成较为一致，由芽孢杆菌属、克罗彭斯特菌属（
Kroppenstedtia）、高温放线菌属（
Thermoactinomyces）、假单胞菌属、葡萄球菌属（
Staphylococcus）等组成。假单胞菌属的相对丰度最高，呈明显的上升趋势（15.84%～76.70%），而芽孢杆菌属在持续下降（43.24%～9.23%）。葡萄球菌属在贮存前9 d的含量较为丰富（12.73%～10.74%），随后立即让位给其他细菌，在贮存第108～161天的相对丰度保持在0.42%～1.67%。随着贮存时间的延长，除了芽孢杆菌属的相对丰度在10%左右波动外，其余在贮存开始时呈明显优势的细菌都在衰减，而乳杆菌属（
Lactobacillus）、放线菌属、链球菌属、肠球菌属（
Enterococcus）等相对丰度增加，这种变化与Jin Yao等的发现一致。由图1b可知，曲皮和曲心在贮存过程中的真菌皆以嗜热子囊菌属（
Thermoascus）为主，其相对丰度在曲皮和曲心中的变化规律大体一致，均从一个极高的相对丰度（96.89%、93.29%）波动下降。其次是曲霉属（
Aspergillus），在贮存第0天几乎没有，而后大量生长，但不同的是从贮存第9天开始，曲霉在曲心中总体呈波动上升趋势（22.17%～30.35%），而在曲皮中呈快速下降趋势（60.82%～2.41%）。毕赤酵母属（
Pichia）在曲心中的相对丰度很低（0%～0.96%），但在曲皮中却大量生长，是曲皮在贮存第108天的绝对优势真菌（68.89%）。
总体看来，大曲贮存过程使曲皮中的魏斯氏菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属和曲心中的高温放线菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、曲霉属的相对丰度得到了极大提高，同时使曲皮和曲心中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜热子囊菌属等的相对丰度下降。此外，曲皮中others的变化情况显示了大曲中一些原本的极低丰度微生物可能由于适应曲库的环境条件以及微生物之间友好的相互关系而大量生长，同时一些微生物因为适应性差而走向衰竭。这些结果都表明贮存使大曲微生物间相互作用重新平衡，改变了微生物群落组成。
1.2 浓香型大曲贮存过程中菌群结构特征的变化
不同贮存时间的大曲微生物
多样性指数如图2所示。Chao1指数反映物种的丰富度，大曲贮存前43 d的微生物丰富度相差不大，随着贮存时间的延长，曲心中细菌的Chao1指数在贮存第108天增长至最大，而真菌的Chao1指数在第43天达到最高值后减小。总体看来，贮存过程使大曲微生物的丰富度略有降低。Pielou’s evenness指数表征均匀度，在大曲贮存期间，微生物群落的均匀度呈现先增加再减少的趋势。贮存第161天的细菌群落均表现出稍稍低于贮存第0天的均匀度，而真菌群落的均匀度总体增加，表明贮存过程塑造了更为均匀的真菌群落。Shannon指数反映物种多样性，大曲的物种多样性与均匀度的变化趋势较为相似，总体上贮存过程增加了大曲的微生物多样性。
为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化，对大曲样品进行PCoA。由图3a可知，PC1和PC2对细菌群落组成差异的解释度分别为29.63%和22.15%，共计51.78%。贮存前43 d的曲心细菌结构相近，但曲皮细菌样本相互分离较远，说明贮存前43 d内曲皮细菌结构发生了明显变化。贮存第108、161天曲心和曲皮的细菌样本各自聚在一起，表明大曲贮存3 个月后，细菌结构已经趋于稳定，这与以往的研究一致。如图3b所示，PC1和PC2对真菌群落组成差异的解释度分别为53.02%和41.79%，总解释度高达94.81%。曲心的真菌结构总体距离相近，说明曲心真菌结构在贮存过程中变化不大，并且与贮存第0、43、161天的曲皮真菌结构相似性较高，但分别与曲皮在第9、108天的真菌结构相差甚远。为进一步了解大曲贮存期间微生物群落结构，Venn图展示了不同贮存时期间的共有微生物及特有微生物数量。如图4所示，在属水平上，曲皮、曲心在5 个贮存时期分别有13、14 个共有物种，其中绝大部分如曲霉属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属、魏斯氏菌属等都属于图1中的优势菌属，但它们在贮存不同时期的相对丰度各不相同。曲皮和曲心在每个贮存时期的特有物种数量总和分别占53%和50%，表明大曲贮存过程中的微生物差异由一半的共有物种的丰度差异和一半的特有物种的物种差异组成。这些结果同样表明一些原本的极低丰度微生物可能会随着贮存的进行大量生长，同时一些微生物丰度降至极低，也有研究显示部分特有低丰度微生物来自贮存环境。
2 浓香型大曲贮存过程中糖化力和液化力的变化
糖化酶是微生物代谢产生的重要酶类，能将酿酒原料中的淀粉、纤维素等多糖降解为还原糖，再由酵母等微生物进一步转化为乙醇，因此糖化力是大曲重要的生化指标。由图5a可知，曲皮糖化力在贮存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在贮存第108～161天内大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之间呈现比较规律的波动。液化酶能断裂淀粉分子的
-1,4-糖苷键生成糊精等中间产物。图5b所示的曲皮液化力在贮存第0～43天内略有降低（0.37～0.12 g/（g·h）），从贮存第43天开始持续增加至贮存结束（0.12～0.30 g/（g·h））。曲心液化力在贮存前43 d内维持在0.08 g/（g·h），之后快速上升并稳定在0.27～0.21 g/（g·h）。总体看来，与以往的研究一致，糖化力和液化力在贮存约43 d内呈下降趋势，随后整体回升。曲皮的糖化力和液化力均在贮存后略微降低，而曲心中的二者在贮存后升高。有研究表明，大曲在贮存初期具有较高的液化和糖化活性，且二者往往呈正相关，后来酶活性降低，转变为较高的酯化活性，这与贮存后期酯类物质含量快速增加有关。
3 浓香型大曲贮存过程中挥发性代谢产物的变化
大曲中的风味物质可以作为酒体中香气物质的直接来源，也可作为酒中香气物质的重要前驱物来源。采用HS-SPME-GC-MS分别在贮存过程的曲心和曲皮位置检测到67、70 种挥发性化合物，可分为醇类、酯类、酚类、酸类、醛酮类、烷烯类、吡嗪类和其他物质。由图6可知，曲皮中风味物质的总含量随着贮存时间呈现先下降后上升再下降的变化趋势，其中在贮存约3 个月时总含量达到最高，这在其他报道中也有同样的发现，相比之下，曲心中的风味物质含量总体较为稳定，仅在贮存结束时发生了较大的下降。酯类物质是中国白酒中令人愉悦的水果、花香、蜂蜜香气的主要贡献者，是贮存期间占比最大的挥发性风味物质，令人注意的是其在曲皮贮存第108天时发生了激增，与前述微生物群落演替结果相结合，推测这种变化可能与魏斯氏菌和毕赤酵母的剧烈增加有关。据报道，魏斯氏菌发酵产生乳酸，为乳酸乙酯的合成提供前体物质，毕赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化过程中发挥重要作用。醇作为酸和酯的重要前体物质，其含量仅次于酯类，在贮存期间变化幅度不大。酸类、烷烯类、醛酮类物质的变化比较一致，表现为贮存初期有较高的含量，之后迅速下降，并在之后的贮存期间保持非常低的含量。总体上，贮存过程使风味物质总含量减少，这与Zhang Yuandi等的研究结果一致。其中醇类物质、酯类物质略微降低，酸类物质、烷烯类物质、醛酮类物质大量减少。结果表明随着贮存时间的推移，一些重要的风味化合物被丰富，一些异杂味被减少或去除，同时伴随着部分风味物质的挥发，说明贮存过程有助于“净化”风味、形成独特浓郁的“大曲味”。
4 浓香型大曲贮存过程中微生物群落的演替机制
为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化原因，采用系统发育零模型计算大曲微生物群落的βNTI来判断群落的构建过程。如图7a所示，曲皮细菌群落的βNTI值在－1.12～5.05之间变化，曲心细菌在－1.28～5.55之间变化，二者的|βNTI|＞2的占比均为40%，说明细菌群落的组装过程主要受60%的随机性过程影响，同时受40%的确定性过程影响。曲皮真菌群落的βNTI值在－0.64～3.61之间波动，其|βNTI|＞2的比例为20%，说明曲皮真菌群落受随机性过程主导（80%）。而曲心真菌仅在－1.52～1.76之间波动，说明其完全受随机性过程影响（100%）。总体上，大曲贮存期间微生物群落的组装主要由随机性过程主导。相较于真菌来说，细菌受确定性过程的影响更大；相较于曲心微生物来说，曲皮微生物受确定性过程的影响更大。
为了进一步量化随机性和确定性过程在贮存期大曲微生物群落构建中的贡献程度，图7b显示了群落的修正RCbray。结果表明无论是曲皮还是曲心，对细菌群落构建的影响因素包括40%的变量选择（环境因子、微生物相互作用等）、40%的扩散限制以及20%的未定义过程（生态漂变等）。而真菌群落则大部分受未定义过程的影响（曲皮70%、曲心90%），说明主要由生态漂变等导致真菌结构发生随机变化。变量选择对曲皮真菌群落构建的贡献为30%，但对曲心真菌的贡献为0。匀质扩散只在曲心真菌群落构建过程中发挥了一定作用（10%），这种生态过程会导致群落结构的相似性。而对于细菌群落来说，相对稳定的贮存环境可能导致扩散限制较大地影响了细菌在曲库中的扩散。有研究表明，真菌群落在曲心中倾向于随机分散，而细菌群落则偏好聚集状态。结果表明，变量选择对微生物菌群（尤其是曲皮中）发挥较大的作用，说明贮存条件的改变及微生物间的相互作用对群落演替十分重要。而目前的生产中，贮存期间几乎都未采取人工调控温湿度等措施，使气候条件成了重要因素，可见在大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量具有重要意义。
大曲贮存过程中微生物的生态位宽度如图8所示。曲心细菌和曲皮真菌在贮存第108天和曲皮细菌在贮存第43天时的生态位宽度发生激增，说明这时候微生物对环境资源的利用程度大大增加，这一时期的变化与图1中优势菌群结构发生剧烈演替相符合。对比贮存前后的生态位宽度，结果显示除了曲皮细菌外，其余菌群的生态位宽度经贮存后都增加，说明贮存使大曲微生物对环境资源的利用增加，对微生物间相互作用的适应状况更好。贮存过程中不同时期的大曲微生物占据着不同的生态位，显示了对环境扰动的不同响应，这种响应是由其生理耐受性、扩散能力、分类多样性和功能多样性等共同介导，因此贮存期大曲微生物群落不同的组装过程可能是受到微生物群对环境干扰的不同响应和生态位宽度的差异所影响。此结果与零模型的分析结果一致反映了贮存环境对大曲微生物生长代谢的重要性。
5 浓香型大曲贮存过程中重要酶活力与微生物群落演替的相关性
贮存期间大曲微生物群落不断变化，并通过代谢活动引起酶活力的变化。通过RDA探究两种重要酶活力与大曲微生物间的关联，其中RDA1和RDA2（加权）标准正交物种得分大于0.09的菌属见图9。如图9a所示，曲皮中，糖化力与嗜热子囊菌属呈负相关，与毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属和曲霉属呈正相关。贮存第108天和第161天的曲皮样本与液化力极为相关，其中属毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属贡献最大。由图9b可知，曲心中的糖化力和液化力均与科萨克氏菌属（
Kosakonia）呈负相关，与嗜热子囊菌属、曲霉属呈强正相关，相比之下，与嗜热真菌属（
Thermomyces）、高温放线菌属的正相关性较弱。结果显示，毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属等微生物通过代谢作用有助于提高糖化酶、液化酶活力。一些研究报道了嗜热子囊菌属、曲霉、根毛霉属及芽孢杆菌属等大曲核心微生物具有强大的水解能力，有助于淀粉的液化和糖化，为后续风味化合物的形成打下基础。
6 浓香型大曲贮存过程中挥发性风味物质与微生物群落演替的相关性
为探究大曲贮存期间挥发性风味物质的变化机制，利用Spearman相关性分析评估挥发性化合物与微生物的关联。如图10a所示，曲皮中一些酯类物质如9-十六碳烯酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、十八烯酸乙酯与根霉属（
Rhizopus）、威克汉姆酵母属（
Wickerhamomyces）等呈显著负相关。乙酸乙酯与黄杆菌属（
Flavobacterium）、假单胞菌属呈显著正相关，与放线菌属、链格孢属（
Alternaria）、棒状杆菌属（
Corynebacterium）、梭杆菌属（
Fusobacterium）等呈显著负相关。并且苯乙醇也和这些菌属呈显著负相关，而与假单胞菌属、克罗彭斯特菌属呈显著正相关。乙醇、正戊醇、2,3-丁二醇聚为一类，与醋杆菌属（
Acetobacter）、链霉菌属（
Streptomyces）呈极显著正相关。有研究显示，大曲中的苯乙醇、戊醇等高级醇可能是通过Ehrlich代谢途径的氨基酸分解代谢形成，也可能是由一些微生物菌株的脂质氧化形成。在曲皮中仅检测到2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪两种吡嗪物质，均与假单胞菌属、克罗彭斯特菌属呈显著正相关。如图10b所示，在曲心中检测到了更多吡嗪种类，其中2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪与魏斯氏菌属、乳杆菌属、肠球菌属呈显著负相关，与芽孢杆菌属、嗜热子囊菌属呈显著正相关；而2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪则与微小杆菌属（
Exiguobacterium）、短状杆菌属（
Brachybacterium）、热杆菌属（
Thermobacillus）呈极显著正相关，这与以往的研究一致，因此通过调节这些微生物的丰度和活性有助于白酒中作为健康因子的吡嗪含量的提升。据报道，芽孢杆菌通过分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等将淀粉和蛋白质转化为葡萄糖和氨基酸，从而产生挥发性化合物及其前体物质，如吡嗪、芳香族化合物、酚类化合物和有机酸，可见芽孢杆菌对大曲的风味和质量有着重要贡献。曲心中辛酸乙酯、癸酸乙酯、十七酸乙酯等与根霉属、克雷伯菌属（
Klebsiella）呈显著正相关，与威克汉姆酵母属呈显著负相关。正己酸乙酯与魏斯氏菌属、肠球菌属、乳杆菌属以及一些非优势菌如栖热菌属（
Thermus）、克洛氏菌属（
Crossiella）等呈显著正相关。总之，大曲贮存过程中挥发性风味物质在很大程度上受到微生物结构及其代谢活性复杂变化的影响，是风味物质挥发和微生物转化共同作用的结果，此结果为后续考虑通过物种强化提高大曲风味质量提供一定的理论基础。
结论
本研究利用高通量测序探究浓香型大曲贮存过程中的微生物群落组成及结构特征。结果显示大曲的贮存过程是微生物进一步相互作用并重新平衡群落结构的过程，长时间的贮存改变了功能微生物比例，最终导致微生物多样性增加、群落结构趋于稳定、均匀。贮存结束后，成熟大曲的曲心微生物群落主要由芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、高温放线菌属、克罗彭斯特菌属、乳杆菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属等组成；曲皮微生物主要包括魏斯氏菌属、乳杆菌、高温放线菌属、嗜热子囊菌属、毕赤酵母属等优势微生物。此外研究了糖化力、液化力以及挥发性风味物质的变化规律，发现贮存过程使曲皮中糖化力、液化力有所下降，但在曲心中有所增加，同时有助于风味物质的丰富和转化，这些变化使曲香更加浓郁。通过构建零模型探索微生物群落的组装机制，发现随机性过程主导了群落结构的变化，同时确定性过程也有重要影响，其中变量选择发挥了较大的作用，生态位差异也有一定影响，这一结论还需更多的研究验证。多元统计分析显示微生物区系与大曲糖化力、液化力及挥发性代谢产物之间有显著相关性，说明贮存有助于通过改变微生物群落生产出高质量大曲。
总之，贮存过程对大曲微生物群落结构的重新平衡、酶活力及挥发性代谢产物的积累与转化具有重要意义，这与Fan Guangsen等的研究结果一致。引起这些变化的确定性过程是变量选择，说明大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量非常重要。此外，还应对微生物的代谢通路进行分析，进一步完善贮存期间大曲品质的变化机制。本研究对优化大曲的贮存工艺、提高大曲品质具有重要意义。
本文《 浓香型大曲贮存期微生物群落演替及代谢产物的变化机制》来源于《食品科学》2023年44卷第22期225-234页，作者徐千惠，饶家权，邹永芳，张 明，罗惠波，黄 丹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230228-257
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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