撰文丨王聪
编辑丨王多鱼
排版丨水成文
基因和细胞疗法正在成为治疗各种疾病（包括癌症、遗传性疾病、心血管疾病和缺血性卒中等）的有前景的治疗策略。 由于基于CRISPR-Cas9基因编辑的治疗策略取得了成功，人们越来越需要以高通量、高效和生物相容性的方式将大质粒递送到细胞内。
原代T细胞和干细胞通常具有强大的细胞内防御机制，会限制外源DNA或RNA进入细胞核。细胞质中的核酸酶还会降解或清除细胞质中的质粒DNA（pDNA），导致转染效率低。因此，对于原代T细胞和干细胞等治疗性细胞，传统的基于病毒载体、阳离子脂质或电穿孔的技术递送效率偏低，难以将大片段核酸转染至这些细胞中。
此外，T细胞和干细胞对外界刺激敏感，基于病毒的转染可能触发免疫应答，影响其活性和功能。电穿孔通常需要特定的高电导率缓冲液和强电场，这可能会对基因和细胞造成不可逆的副作用（包括导致免疫功能下降的基因改变，严重的细胞损伤，甚至细胞死亡）。因此，大量的研究集中在开发替代转染方法，以满足快速发展的细胞和基因治疗领域的需求。
2024年4月17日，郑海荣院士团队等在Science Advances期刊发表了题为：Acoustothermal transfection for cell therapy 的研究论文。
该研究提出了一种无微泡的声热转染新方法，利用对细胞的声和热效应，增强细胞膜和核膜的通透性，实现对原代T细胞和干细胞的安全、高效和高通量转染。能够将大的质粒以约90%的效率转染到细胞核，且保持细胞活力。小鼠实验显示，用该方法转染CXCR4治疗后的间充质干细胞（MSC）可有效靶向脑缺血部位，缩小小鼠脑梗死体积。
总的来说，这种声热转染方法解决了平衡转染效率和细胞活力的关键瓶颈，有望成为未来细胞和基因治疗的有力工具。
随着微/纳米技术的发展，近年来引入了基于纳米结构和微流体细胞挤压的无载体转染技术，通过 对细胞施加机械力，暂时增加细胞膜和核膜的渗透性，使外源物质进入细胞质和细胞核。虽然基于纳米结构的方法（纳米针和纳米管）可以高效率地将大量货物输送到细胞核中，但这些方法难以扩大规模。此外，微流控细胞挤压方法是利用流体剪切或微收缩使细胞变形，可以将小颗粒高效递送到细胞中，但对于大颗粒质粒任然面临挑战。基于纳米结构或微流控细胞挤压的方法通常还存在堵塞问题，需要重新设计器件结构以处理不同尺寸的细胞。
除了上述技术外，高频声波已被证明通过超声诱导微泡或通过直接对细胞施加声压力实现物理转染的有效方法。尽管基于微泡的超声穿孔技术可以可逆性地打开细胞膜上的孔隙进行细胞内递送，但它们高度依赖于微泡的大小、位置和浓度。此外，微泡的快速崩塌产生的冲击波可能会对细胞和基因造成不可逆的损伤。因此，超声学界正在积极寻找不依赖微泡的超声转染机制。遗憾的是，以往的不依赖微泡的超声技术对原代细胞的转染效率较低（通常低于20%）。低效率和低转染后细胞活力限制了现有超声技术的临床应用，特别是在供体细胞数量有限的自体细胞治疗应用中。
总体而言，超声转染方法和其他现有的物理转染技术尚未同时实现以下对基因和细胞治疗至关重要的特征，包括1）将基因递送到难转染细胞（例如原代T细胞和干细胞）的细胞核内实现快速和高效转染；2）同时递送多种类型的大质粒以表达多种基因产物；3）转染后细胞的体内功能的全面展示。
在这项研究中，研究同样的提出了一种 无微泡的声热转染 （bubble-free acoustothermal transfection） 技术，该技术利用表面声波（surface acoustic wave，SAW）引起的声和热效应联合作用，增强细胞膜和核被膜的瞬时通透性，实现对难以转染细胞的安全、高效、高通量转染。
该技术不仅利用细胞上的声压力来穿孔细胞膜，而且利用声波的粘性阻尼引起的热脉冲，使核膜更容易穿孔。研究团队发现，利用该技术，MCF-7细胞可以在5分钟内通过增强细胞膜和核被膜的通透性将大的功能性物质运送到细胞质和细胞核，细胞活力为89.7±0.8%。
此外，该技术是可扩展的，多个声热转染单元可以进行集成，以6×8个平行单位在1分钟内可转染近170万个细胞。该研究证明了该转染方法能够有效地将质粒递送到难转染细胞的细胞核中，包括间充质干细胞（MSC）和原代T细胞。例如，转染CXCR4质粒后14小时后，荧光显像和流式细胞仪检测转染效率分别为89.0±0.9%和82.6%。转染脑源性神经营养因子（BDNF）质粒后，荧光显像和流式细胞仪检测转染效率分别为90.3±2.4%和86.7%。转染两种质粒24小时后，MSC的基因表达效率可达89.6±1.2%。T细胞在24小时内单个质粒的表达量达到85.0±0.6%。通过将转染后的MSC注射到缺血性卒中小鼠模型中，转染的细胞可以在体内实现治疗功能。
总的来说，该研究开发的新型声热转染技术具有高效、高通量和高生物相容性等特点，能够将大的质粒快速递送到难转染细胞中，解决了以往转染方法的关键限制，在生物医学研究和临床应用（例如免疫治疗和基因治疗）中显示出巨大潜力。
论文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk1855