作者 | 孙凌霄1陈媛媛2王启1
单位 | 北京大学人民医院：1.检验科，2.感染科
前言
毛霉病致病真菌属于毛霉目，是环境真菌，广泛分布于空气、发霉食物以及土壤中，其孢子可以通过吸入、食入或者外伤等途径引起人体毛霉病[1]。我国报道的毛霉病中，对致病真菌的种类报道比例较低，以根霉和横梗霉多见[2]。新型冠状病毒感染后继发的毛霉菌感染被成为新型冠状病毒相关性毛霉菌病（COVID-19 associated mucormycosis , CAM），病变可累及鼻、眼眶、中枢神经系统、皮肤、肺等部位。
宏基因组学二代测序（metagenomics next generation sequencing, mNGS）技术不同于传统微生物学检测技术，可通过对患者样本中提取的核酸进行高通量测序，得到病原微生物结果，对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率[3]。本文通过传统微生物学方法与mNGS相结合的方法，诊断1例白血病造血干细胞移植术后合并新型冠状病毒感染继发面部毛霉感染病例。该患者为免疫抑制人群，病程中合并病毒、细菌及真菌感染，病情危重，早期诊断对于提高生存率至关重要。
病例经过
主诉：患者，男，60岁，因“诊断慢性粒单核细胞白血病7个月余，异基因造血干细胞移植后4个月，咳嗽、咳痰10天，憋气4天”于2022.12.21收住院。
现病史：患者7个月余前因腹痛就诊于外院，腹部彩超提示脾大，完善骨髓穿刺活检提示慢性粒单核细胞白血病。患者2022.7.25就诊于我院，复查骨穿，形态学提示增生II级，原始粒细胞4%，成熟单核细胞9.5%。流式分析不除外骨髓增殖性疾病。基因：BCR-ABL融合基因阴性，WT1及PRAME异常高表达，JAK2-V617F、CALR Exon9、MPLW515L/K、SRSF2突变均为阴性。染色体分析：46,XY[20]。2022.8.12开始减低毒性BU/CY 1.0/FLu+ATG方案预处理化疗,环孢菌素，吗替麦考酚酯，短程甲氨蝶呤（MTX）联合预防移植物抗宿主病（GVHD）、复方新诺明预防肺孢子菌感染、更昔洛韦预防病毒感染。并予保肝，止吐，补液支持。患者化疗后出现药物性发热、化疗相关腹泻。
2022.8.22、2022.8.23按计划回输供者外周血干细胞，回输后予MTX、丙球、G-CSF等治疗。移植后出现发热，不除外感染，予万古霉素联合美罗培南抗细菌、卡泊芬净抗真菌治疗、阿昔洛韦预防病毒感染，环孢素及激素抗GVHD治疗。2022.9.29患者CMV病毒阳性，予更昔洛韦联合CMV丙球抗病毒治疗。10天前患者出现咳嗽、咳白色粘痰，鼻塞流涕。4天前自觉憋气，活动后加重，无发热、皮疹，无腹痛、腹泻。自测新冠抗原阳性，1天前完善胸部CT：双肺多发感染。现为进一步诊治收住院。精神、食欲、睡眠尚可，二便正常，体重无著变。
既往、个人、家族史：“冠状动脉硬化性心脏病”病史4个月。造血干细胞移植后患者出现血压升高，以舒张压升高为主。10天前患者家人出现发热、咳嗽症状，自测新冠抗原阳性。
入院查体：T:37℃，P:90次/分R:20次/分BP:120/96mmHg 脉氧87%（不吸氧）。神志清，精神差，全身浅表淋巴结未触及肿大，口腔粘膜完整，皮肤无新发出血点。双肺呼吸音粗，可闻及散在湿啰音。心律齐，未闻及杂音。双下肢水肿。
辅助检查：血常规WBC 4.13×109/L，NE 3.44×109/L，LY 0.5×109/L，HB 117g/L，PLT 59×109/L。心肌损伤标志物、BNP、肝肾功能未见明显异常。血气分析：PH 7.414 PCO2 23.3mmmHg，PO2 66.8mmHg，氧饱和度93.2%，钾5.0mmol/L，钠133.7mmol/L，BE -7.2 mmol/L，SB 18.5mmol/L，AB 15.1mmol/L。新冠核酸阳性（见表1）。胸部CT（见图1）：双肺多发感染。
初步诊断：呼吸衰竭（Ⅰ型），肺炎，新型冠状病毒感染，慢性粒单核细胞白血病，异基因造血干细胞移植术后，冠心病，高血压。
表1 患者住院期间新型冠状病毒核酸结果
注释：NA: Not available.2022.12.22及2022.12.29我院新冠核酸结果未报告N基因及ORF基因CT值。
图1 胸部CT（2022.12.20）：双肺多发双肺多发片状磨玻璃密度影及条片影。
患者12.21夜间喘憋加重转入重症监护病房，面罩吸氧不能维持，于12.23改为经鼻高流量吸氧，并予奈玛特韦/利托那韦抗病毒、激素、环孢素、阿昔洛韦、泊沙康唑、磺胺等治疗。
12.25患者经鼻高流量吸氧60L/min情况下，呼吸频率波动于35-41次/分，复查床旁胸片提示双肺多发感染（图2A），完善血气分析：PH 7.40，PCO2 24.9mmmHg，PO2 84.4mmHg，氧饱和度96.2%，钾4.4mmol/L，钠134.2mmol/L，BE -9.3 mmol/L，SB 18.6mmol/L，AB 15.7mmol/L。行气管插管及气管镜检查术，留取分泌物培养未见阳性结果，并予舒普深3g q8h感染治疗。12-27复查床旁胸片（图2B）双肺感染较前减轻。患者仍有发热，改为美平0.5g q4h抗细菌，卡泊芬净50mg qd抗真菌治疗。
图2 胸部X线变化。A 12-25胸片双肺多发感染，双侧胸腔积液可能；B 12-27胸片双肺感染，较前明显减轻；C 12-31胸片双肺感染，较前略加重。
12.30患者血培养回报危急值，45小时回报G阳性杆菌，加用利奈唑胺抗感染治疗。复查新冠核酸仍阳性（N基因25.58，ORF基因29.65）（见表1），继续奈玛特韦/利托那韦抗病毒治疗，并加用丙种球蛋白治疗。
12.31血培养回报G+棒状杆菌，加用替加环素、头孢他啶阿维巴坦抗感染治疗。
2023.1.3患者复查新冠核酸仍阳性（N基因31.63，ORF基因32.65）（见表1），继续奈玛特韦/利托那韦抗病毒治疗。
1.5复查胸部CT双肺感染较前加重（图3），1.6将头孢他啶阿维巴坦改为头孢他啶抗感染治疗，并予间断俯卧位通气治疗。
图3 胸部CT（2023.1.5）：双肺多发感染，较前增多、增重。肺动脉较前增宽。心包少量积液，双侧新发胸腔积液。
1.9血培养回报危急值：需氧瓶报警，涂片可见革兰阴性杆菌，将头孢他啶改为美罗培南抗感染治疗。1.12血培养正式报告为肺炎克雷伯菌（CRKP，产KPC酶），改为头孢他啶阿维巴坦抗感染治疗；
1.11患者体温仍高，新冠核酸仍未转阴，继续口服奈玛特韦/利托那韦。
1.16发现患者口周破溃，专科查体：左侧面部可见散在紫黑色斑、结痂，左侧口唇可见大片坏死，表面无渗液、脓液，右侧口角结痂。两侧颈部可见小片糜烂（见图4）。皮肤溃烂处培养出马拉色菌。提请皮肤科会诊，建议完善病原学培养，可局部外用药膏、抗病毒等治疗。
图4 面部多发散在紫黑色斑、结痂
1.17提请呼吸科及感染科会诊，呼吸科会诊：考虑目前免疫力低下，根据胸片及肺CT结果不支持肺真菌感染，但面部皮损考虑真菌感染可能性大，积极留取皮肤组织培养，涂片。皮肤屏障破坏，与外界相通，应警惕金葡菌感染风险，感染致命，可给予万古霉素预防治疗。继续呼吸机支持，整体预后不佳。感染科会诊：结合患者皮损形态，联系微生物室，目前考虑毛霉菌引起皮肤感染可能性大；建议改为艾沙康唑或两性霉素B脂质体治疗。
1.18患者面部皮损、黑痂明显，再次送培养。微生物室回报找到毛霉菌。同时血NGS结果回报（表2）分枝横梗霉（90序列）、微小根毛霉（80序列）、细环病毒（145序列）、巨细胞病毒（26序列），考虑毛霉引起面部皮肤感染、血流感染诊断明确。血液科主任查房后示：患者新冠肺炎、呼吸衰竭诊断明确，经抗病毒、激素治疗后核酸未转阴、氧合改善不明显，同时出现严重面部皮肤真菌感染，建议激素减量，应用两性霉素B脂质体抗毛霉菌治疗，同时加利奈唑胺抗感染治疗，面部破溃处定时换药。
表2 血NGS结果
注释种特异序列：指在种水平上检出的该微生物的特异性序列数目；覆盖度：指检出的该微生物所有序列经向基因组回拼后，能够覆盖该物种基因组的百分比；相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物物种序列在相应大类物种（通常分成细菌、真菌、病毒、寄生虫4大类）中的分布比例；RPMratio：样本中物种的种特异序列与阴性对照中相应物种种特异序列的比值。
1.19协和医院会诊：患者CRE血流感染，应用思福妥药物治疗有效，继续思福妥抗感染。面部霉菌感染，需进一步检查明确感染范围，包括鼻窦、颅内、肺。毛霉菌的治疗非常困难，外科干预很重要，但目前患者无法耐受手术；药物治疗可考虑二性霉素B联合艾沙康唑，是最强的治疗毛霉菌感染的方案。
1.20复查胸部CT（图5）双肺感染较前进一步加重。加用艾沙康唑及注射用两性霉素B脂质体抗真菌治疗，继续面部患处涂抹两性霉素B，密切关注患者氧合及面部感染状况。
1.23患者面部出现大面积破溃、结痂，抗感染治疗后感染面积逐步扩大，出现菌血症。患者病情危重，循环不能维持，需要大剂量血管活性药物维持，家属放弃治疗，办理自动出院。
图5 胸部CT（2023.1.20）：双肺多发感染，双侧胸腔积液，较前增重。
案例分析
01
临床案例分析
该患者为慢性粒单核细胞白血病行异基因造血干细胞移植术后，因咳嗽、喘憋入院，查新型冠状病毒阳性，胸部CT提示双肺多发感染，考虑新型冠状病毒感染引起的肺炎诊断明确。病程中合并呼吸衰竭，经面罩、经鼻高流量吸氧氧合改善不佳，遂行气管插管接呼吸机辅助通气。多次应用奈玛特韦/利托那韦、激素等治疗新冠核酸未彻底转阴、肺炎进展。间断俯卧位通气，患者出现面部皮损，表现为紫黑色斑、结痂。微生物化验室起初回报马拉色菌，但通过与皮肤科、化验室、感染科等沟通，考虑毛霉感染可能性大。再次送检皮肤病原学、完善血mNGS，结果回报分支横梗霉、微小根毛霉，考虑毛霉引起的面部感染、血流感染诊断基本明确。虽经过两性霉素B脂质体联合艾沙康唑治疗，但病情进展迅速，家属放弃治疗，预后很差。
近年来，毛霉菌病的发病率不断升高且死亡率高，免疫缺陷患者是毛霉菌病的高危人群。有研究发现毛霉菌感染患者中，为恶性血液肿瘤患者占40.2%，异基因造血干细胞移植患者占35%。新型冠状病毒肺炎患者中0.9%~33.3%继发真菌感染[4, 5]，曲霉菌和念珠菌被认为是主要的病原体，而在COVID-19流行期间，毛霉菌感染呈现上升趋势。这种趋势可能与糖皮质激素、高血糖、病毒感染、铁代谢、应用免疫抑制剂等相关[6, 7]。
毛霉菌感染中最常见的临床表现为肺毛霉菌病，其次是皮肤、鼻眶脑毛霉病。在合并COVID-19的毛霉感染中，鼻眶毛霉菌是最常见的表现，其次是肺毛霉病。在CAM中皮肤型的相关病例很少，主要为病例报道[8]，主要表现为皮肤出现伴有周围红斑和硬结的坏死焦痂。本例患者主要表现为皮肤毛霉病，同时血mNGS检出分支横梗霉、微小根毛霉，证实同时存在毛霉血流感染。
02
检验案例分析
如何帮助临床诊断毛霉菌感染？
该病例是一例罕见的由微小根毛霉引起的面部毛霉感染，患者慢性粒单核细胞白血病行异基因造血干细胞移植术后，合并新型冠状病毒肺炎，多次应用激素等治疗，为毛霉菌病高危人群。病程中患者出现面部皮损，表现为紫黑色斑、结痂，完善相关病原学检查，结合真菌涂片形态和病史考虑为马拉色菌，但通过与临床科室沟通，考虑毛霉感染可能性大。进一步完善血mNGS检出分支横梗霉、微小根毛霉，考虑毛霉引起的面部感染、血流感染诊断明确。
该患者为免疫缺陷患者，合并新型冠状病毒肺炎，多种治疗效果不佳，病情危重。在高度怀疑感染性疾病而使用多种传统微生物学检测方法仍不能明确病原学时，可考虑完善mNGS。对于真菌感染患者，mNGS较传统真菌培养，可明显缩短检测时间。
知识拓展
毛霉病是一种条件性真菌感染，可侵犯人体的鼻、脑、肺、胃肠道、皮肤等部位，甚至可通过血行播散到全身各个脏器，其病程可呈急性、亚急性或慢性。
病原学：在致病性毛霉目真菌中，根霉属最常见，其次为横埂霉属、毛霉属、根毛霉属和小克银汉霉属等[9]。
流行病学：毛霉菌属为常见的污染菌之一，系条件致病菌。本菌多寄生于土壤、肥料及水果上。通常发生在严重糖尿病、造血干细胞移植、或恶性肿瘤等免疫缺陷患者中。
临床特点：毛霉病可分为至少6个临床类型：鼻眶脑、肺、皮肤、胃肠道、播散性和其他。肺型和脑型常继发于严重的糖尿病、造血干细胞移植、或恶性肿瘤等免疫缺陷患者中。
诊断：对于免疫缺陷患者，如怀疑此病，立即做涂片直接镜检、真菌培养和组织病理查找病原体。血培养阳性有助于诊断。对于诊断困难的危重患者，必要时完善mNGS。
治疗：包括对受累组织型手术清创联合抗真菌治疗。两性霉素B是初始治疗的首选药物，对于对两性霉素B脂质制剂有反应的患者，泊沙康唑或艾沙康唑可用作口服降阶梯治疗。
案例总结
该患者为慢性粒单核细胞白血病行异基因造血干细胞移植术后，因咳嗽、喘憋入院，查新型冠状病毒阳性，胸部CT提示双肺多发感染，考虑新型冠状病毒感染引起的肺炎诊断明确。病程中合并呼吸衰竭，经面罩、经鼻高流量吸氧氧合改善不佳，遂行气管插管接呼吸机辅助通气。多次应用奈玛特韦/利托那韦、激素等治疗新冠核酸未彻底转阴、肺炎进展。间断俯卧位通气，患者出现面部皮损，表现为紫黑色斑、结痂。微生物化验室起初回报马拉色菌，但通过与皮肤科、化验室、感染科等沟通，考虑毛霉感染可能性大。再次送检皮肤病原学、完善血NGS，结果回报分支横梗霉、微小根毛霉，考虑毛霉引起的面部感染、血流感染诊断基本明确。虽经过两性霉素B脂质体联合艾沙康唑治疗，但病情进展迅速，家属放弃治疗，预后很差。
临床中如怀疑真菌感染，及时完善病原学检测，首先完善涂片及培养，若传统实验室检查结果无阳性提示，病情危重情况下可完善mNGS明确病原学，以协助临床诊断、治疗。
专家点评
王启，副主任技师，北京大学人民医院检验科
近年来，毛霉病发病率不断升高，且不同人群的患病风险差异很大。糖尿病、血液系统恶性肿瘤、实体器官或造血干细胞移植是常见的危险因素。毛霉菌病表现为菌丝侵犯血管导致的宿主组织梗死和坏死，其进展通常很快。
为尽快确诊，应在适当的临床情况中早期考虑毛霉菌病，并积极完成病原学检查。诊断依赖于通过组织病理学发现组织中的微生物，并经培养确诊。然而，受临床经验用药限制，培养经常为阴性结果。而PCR检测、mNGS检测等新兴分子诊断技术则为明确诊断提供新的方向，通过与临床科室的密切沟通，传统实验室检测技术与新兴分子诊断技术的结合，为患者的诊断提供帮助。
参考文献
1 中国医药教育协会真菌病专业委员会,中国毛霉病专家共识工作组.中国毛霉病临床诊疗专家共识（2022）[J].中华内科杂志,2023,62(6):597-605.
2 Wei LW, Zhu PQ, Chen XQ, Yu J. Mucormycosis in China: A Systematic Review of Case Reports. Mycopathologia. 2022;187(1):1-14.
3《中华传染病杂志》编辑委员会.中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J].中华传染病杂志,2020,38(11):681-689.
4 Ripa M, Galli L, Poli A, et al. Secondary infections in patients hospitalized with COVID-19: incidence and predictive factors. Clin Microbiol Infect. 2021;27(3):451-457.
5 Chong WH, Saha BK, Ananthakrishnan Ramani, Chopra A. State-of-the-art review of secondary pulmonary infections in patients with COVID-19 pneumonia. Infection. 2021;49(4):591-605.
6 Sen M, Honavar SG, Bansal R, et al. Epidemiology, clinical profile, management, and outcome of COVID-19-associated rhino-orbital-cerebral mucormycosis in 2826 patients in India - Collaborative OPAI-IJO Study on Mucormycosis in COVID-19 (COSMIC), Report 1. Indian J Ophthalmol. 2021;69(7):1670-1692.
7Edeas M, Saleh J, Peyssonnaux C. Iron: Innocent bystander or vicious culprit in COVID-19 pathogenesis?. Int J Infect Dis. 2020;97:303-305.
8 Khatri A, Chang KM, Berlinrut I, Wallach F. Mucormycosis after Coronavirus disease 2019 infection in a heart transplant recipient - Case report and review of literature. J Mycol Med. 2021;31(2):101125.
9Roden MM, Zaoutis TE, Buchanan WL, et al. Epidemiology and outcome of zygomycosis: a review of 929 reported cases. Clin Infect Dis. 2005;41(5):634-653.
编辑：笪文武 审校：陈雪礼