微生物 CRISPR-Cas 系统素有「大自然魔剪」之称,2020 年斩获诺贝尔化学奖桂冠后,将生命科学带入新征程,开启了基因编辑新时代,被广泛设计用于操纵人类细胞中的目标 DNA 或 RNA 序列。

科学家们围绕着 CRISPR-Cas 系统攻克出喜人成果,创造了一个又一个科研奇迹,为人类的生命健康安全保驾护航。以博德研究所张锋团队为典型代表,其相关研究成果如雨后春笋般出现在科研进展一线,为 CRISPR-Cas 系统发展做出了重要贡献。

值得一提的是,仅在 2023 年间,张锋团队在 Cell、Science 和Nature 杂志发表论文已超过 5 篇。仅仅在 11 月,就接连在 BMC Biology、PNAS、Science 发表了 3 篇文章!

2023 年 11 月 23 日,张锋实验室和 NCBI-NIH 的 Eugene V. Koonin 团队联合在 Science 杂志发表研究论文 “Uncovering the functional diversity of rare CRISPR-Cas systems with deep terascale clustering”。

该研究开发了新型聚类分析工具——FLSHclust,FLSHclust 遍历数十亿蛋白序列,实现了每秒万亿次(太拉级)运算,快速定位敏感聚类分析。FLSHclust 的聚类分析表现可以和著名序列分析算法 MMseq2 相媲美,能够对海量数据集进行深度聚类,发现了 188 个之前未见报道的新型 CRISPR-Cas 相关系统,揭示了许多与适应性免疫相关的生化功能

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图片来源:Science

本研究通过实验鉴定了三个含 HNH 核酸酶的 CRISPR 系统,包括第一个具有特定干扰机制的 IV 型系统,并将它们设计用于基因组编辑。此外,还鉴定了一种候选的 VII 型系统,并证明了它对 RNA 的作用。

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总之,这项研究结果可以快速高效地对数百万个序列进行聚类,并将适用于涉及挖掘大型数据库的各种研究,为推动生物学进步增添新技术。同时,为利用 CRISPR 系统和更广泛地探索微生物蛋白质的巨大功能多样性开辟了全新的途径,揭示了 CRISPR 系统前所未有的组织和功能灵活性和模块化,但也表明大多数变体是罕见的,只存在于相对不寻常的细菌和古细菌中。

显然,在原核生物数十亿年的进化过程中,数量有限的最合适变体通过水平转移广泛传播,阻止了大多数新出现变体的广泛传播。为何那些(相对)少数成功的变体具有更高适能性,将是一个引人兴趣的问题。

上述工作并非是两个团队第一次合作,不久前,张锋团队联合 Eugene V. Koonin 团队在 PNAS 杂志发表研究论文 “Diversity, evolution, and classification of the RNA-guided nucleases TnpB and Cas12”,探究了 TnpB 蛋白在转座子生命周期中的功能

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TnpB 蛋白是与转座子相关的 RNA 引导核酸酶,是细菌和古细菌基因组中编码的最丰富的蛋白质之一,但其在转座子生命周期中的功能尚不清楚。CRISPR-Cas RNA 引导的核酸酶 Cas9 和 Cas12 是新一代基因组编辑方法的主要工具。其中,Cas12 被认为是 TnpB 进化而来。

该研究对古生菌和细菌基因组中的 TnpB 进行了全面的进化分析,构建系统进化树,绘制了这些蛋白质的各种特征,以揭示一组非常多样化的基因组编辑候选系统。研究结果表明,在大约 50 个独立情况下,TnpB 可以进化出 V 型 CRISPR-Cas 效应器。此外,TnpB 还被招募用于其他不同的功能,主要是调节功能,这伴随着核酸酶催化位点的失活。这些发现揭示了转座子编码蛋白的广泛功能和进化灵活性,并为进一步探索 RNA 引导的生物系统和多种应用提供了多种途径。

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张锋团队除了在 CRISPR-Cas 系统研究领域深耕,其在延伸领域也大放异彩。

基因组区域的重复等变异与很多疾病息息相关,长久以来开发针对这些基因组复制的策略具有极大的挑战。

2023 年 11 月 14 日,张锋团队联合麻省理工学院 Fernando J. Bustos 等在 BMC Biology 杂志发表研究论文 “Removal of a partial genomic duplication restores synaptic transmission and behavior in the MyosinVA mutant mouse Flailer”,该研究使用 DN-CRISPRs 去除部分基因组复制,发现能够恢复肌球蛋白 VA 突变小鼠 Flailer 的突触传递和行为

图片来源:BMC Biology

研究人员使用自闭症谱系障碍(ASD)和焦虑小鼠模型 Flailer,其含有部分基因组重复,是 MyoVa 的显性阴性,展示了如何使用 DN-CRISPRs 在体外和体内移除 700bp 的基因组区域。

令人惊喜的是,在小鼠原发性大脑皮层神经元中编辑 Flailer 基因可恢复突触运输和传输缺陷。此外,Flailer 动物体内被破坏的长期抑郁(LTD)在基因编辑后也得到了恢复。在体内传递 DN-CRISPRs 表明,向腹侧海马局部传递 DN-CRISPRs 可以挽救一些突变行为。

总之,该研究证明 DN-CRISPR 具备潜力去除较大的基因组重复,为治疗神经退行性疾病提供了新思路!

CRISPR 系统大放异彩,在生物学研究领域中的实力不容小觑,注定在历史上书写浓墨重彩的一笔,让我们拭目以待!

参考资料

[1] Altae-Tran H, Kannan S, Suberski AJ, et al. Uncovering the functional diversity of rare CRISPR-Cas systems with deep terascale clustering. Science. 2023;382(6673):eadi1910. doi:10.1126/science.adi1910

[2] Altae-Tran H, Shmakov SA, Makarova KS, et al. Diversity, evolution, and classification of the RNA-guided nucleases TnpB and Cas12. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(48):e2308224120. doi:10.1073/pnas.2308224120

[3] Bustos FJ, Pandian S, Haensgen H, et al. Removal of a partial genomic duplication restores synaptic transmission and behavior in the MyosinVA mutant mouse Flailer. BMC Biol. 2023;21(1):232. Published 2023 Nov 14. doi:10.1186/s12915-023-01714-y

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