本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。
Introduction
消费者对健康和生活质量的日益关注，增加了对具有功能特性和对人体健康有积极影响的天然产品的需求。开发含有天然成分的新食品已成为促进健康的饮食策略。羊奶经过不同的工艺处理，制成了多种品质优良、接受度高的发酵乳制品。羊奶和牛奶在蛋白质、脂肪和乳糖含量方面有相似之处；然而，一些差异(例如氨基酸组成、酪蛋白胶束的物理化学性质、蛋白质和脂质之间的聚集以及较小的脂肪球和脂肪酸链长度)赋予了羊奶低过敏性和高消化率，这些特性越来越受到消费者的兴趣。
饮食对肠道菌群的组成和代谢活性有很大影响，被认为是与肠道菌群多样性改变相关的慢性疾病发生的重要影响因素。肠道菌群调节的重要性日益增加，促使人们寻找能够积极影响肠道菌群的化合物，从而有益于宿主健康。
与膳食纤维类似，酚类化合物被认为能够为肠道微生物群提供益处。大多数膳食中的酚类化合物在小肠中不被吸收，而是到达结肠，并在结肠微生物群中进行强烈的生物转化。除了增加种群数量和刺激形成肠道微生物群的有益群的代谢活性外，这种转化应该产生更活跃和生物可利用的酚类化合物形式。
伊莎贝尔葡萄(Vitis labrusca L.)是巴西种植最多的葡萄品种之一，主要用于自然消费和果汁生产。伊莎贝尔葡萄精心制作的低热量制剂和从衍生固体副产品(种子和果皮)中获得的面粉的整体使用，使得产品具有高含量的纤维和具有抗氧化活性的花青素，除了与水果农工部门采用的新兴零残留物策略相关的方法。
将这些来自伊莎贝尔葡萄整体价值的成分掺入山羊酸奶应该是一种增加产品价值和增加消费者酚类化合物摄入量的策略。研究发现葡萄纤维和酚类化合物对益生菌以及人体肠道菌群的组成和代谢活性有积极作用。然而，衡量山羊乳制品中富含酚类成分对益生菌和人类肠道微生物群影响的研究仍然有限。
本研究推测，在体外结肠发酵过程中，由富含酚类和纤维的伊莎贝尔葡萄成分配制的山羊酸奶可以对益生菌产生刺激作用，并引起人体肠道微生物群的变化。为此，在以伊莎贝尔葡萄低热量制剂和其固体副产品制成的面粉配制的山羊酸奶培养基中，不同益生菌的活菌计数和代谢活性，以及体外结肠发酵过程中人类肠道微生物群的细菌数量和代谢活性的变化。
Results and discussion
山羊酸奶配方对益生菌活菌数量的影响
益生菌嗜酸乳杆菌La-05、干酪乳杆菌LAFTIL-26和乳酸乳杆菌Bb-12在消化山羊酸奶配方(YC、YP和YPF)、葡萄糖和FOS培养基中培养48 h的活菌计数如图1所示。在含有YC、YP、YPF、葡萄糖和FOS的培养基中培养24 h后，所有益生菌的活菌数均>8(lg (CFU/mL))，培养48 h后，除嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在含有FOS的培养基中培养外，其余益生菌的活菌数均下降。但培养48 h后，所有益生菌的活菌数均>7(lg (CFU/mL))。与这些结果一致的是，一项早期研究报道，乳杆菌种类通常在培养约24小时后达到最大生长。也有报道称，B. lactis通常在培养8~16 h时达到最大生长，并且在培养48 h时生长可以保持不变。然而，在本研究中，乳芽孢杆菌Bb-12在培养约12小时时显示出最高的活菌数，随后在培养48小时后活菌数减少，特别是在含有山羊酸奶样品的培养基中。这些结果之间的差异可能与本研究中使用的菌株(即B. lactis Bb-12)的特定代谢特性有关，随着时间的推移，影响了其利用培养基中所检测的山羊酸奶配方中可用营养素的能力。
在培养48 h结束时，与YC、YP和YPF培养基相比，FOS和葡萄糖培养基中所检测的益生菌活菌数更高。与零小时相比，检测的益生菌在FOS和葡萄糖培养基中培养48小时后的活菌计数增加了2.0~2.5(lg (CFU/mL))。这种行为可能与益生菌偏好使用葡萄糖作为主要碳源有关。然而，YC、YP和YPF在培养48 h后也使所检测的益生菌活菌数增加(1~2 (lg (CFU/mL))，增强了它们刺激这些微生物生长的能力。碳水化合物，如在YC、YP和YFP中发现的乳糖，以及在YP和YPF中发现的果糖和纤维，也可以作为可发酵底物来促进所研究的益生菌的生长。
图1 嗜酸乳杆菌La-05 (A)、干酪乳杆菌L-26 (B)和动物乳杆菌亚群活细胞计数b-12 (C)，培养48 h
山羊酸奶配方对益生菌代谢活性的影响
无论接种何种益生菌，在整个培养期间，不同单一碳源培养基的pH值均呈下降趋势(P < 0.05)(表1)，这表明这些培养基中益生菌代谢活性很强。无论接种何种益生菌，在含有FOS和葡萄糖的培养基中，培养48 h的pH值最低。对于山羊酸奶配方的培养基，总体而言，YP和YPF培养基的pH值最低，其次是YC培养基。
无论添加碳源和接种何种益生菌，培养基中乳酸和乙酸的含量在培养48 h期间均有所增加(表1)。与其他测定的有机酸相比，乳酸是不同培养中含量最高的有机酸。培养48 h后乳酸含量最高的培养基是分别接种嗜酸乳杆菌和乳酸芽孢杆菌的葡萄糖培养基(P < 0.05)，这可能与这些培养基的pH值较低有关。
乙酸含量总体上以接种乳酸菌的YC、YP和YPF培养基最高(P < 0.05)。嗜酸乳杆菌接种的YC、YPF和葡萄糖培养基的乙酸含量均高于FOS培养基(P < 0.05)。培养48 h时，接种干酪乳杆菌的YC、YP和YPF培养基的乙酸含量均高于葡萄糖培养基(P < 0.05)，低于FOS培养基(P≥0.05)。乳酸和乙酸被乳酸菌和双歧杆菌视为葡萄糖和果糖代谢的主要最终产物，其含量的增加应与培养培养基中接种的益生菌代谢强相关。
总体而言，接种嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸乳杆菌的山羊酸奶培养基柠檬酸初始含量较高(P < 0.05)。在不同培养基中，无论添加碳源还是接种益生菌，培养48 h后柠檬酸含量均下降。在含有FOS或葡萄糖的培养基中未发现琥珀酸。在不同山羊酸奶配方培养基中培养48 h，柠檬酸含量发生变化。然而，无论接种何种益生菌，在YPF培养基中培养48 h时，琥珀酸含量均下降(P< 0.05)。柠檬酸和琥珀酸天然存在于葡萄及其衍生产品中，但乳酸菌在不同发酵条件下也可产生柠檬酸和琥珀酸。
pH值的降低和有机酸含量的增加是与培养基中接种的益生菌代谢有关的参数。培养基中pH值和有机酸含量与YC、YP和YPF的关联，以及接种的益生菌活菌数的增加，强化了山羊酸奶配方对这些微生物的生长刺激作用。被测益生菌降低培养基pH值和产生有机酸能力的差异可能与被测物种或菌株的不同代谢特性有关，这些特性影响了它们利用培养基中可用的营养物质增加种群和产生不同代谢物的能力。
表1 不同培养基在48 h内的pH值和有机酸含量
山羊酸奶配方对结肠菌群目标菌群的影响
通过对人体肠道微生物群主要类群的调查，评价发酵过程中样品对微生物群生长和代谢活性的影响。real-time PCR评估的粪便微生物群组成及平均拷贝数见表2在评估的组中有厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，它们是人类肠道中4个优势门中的3个，所获得的结果与健康人类志愿者粪便中的结果一致，例如乳酸菌，通常在正常肠道微生物群中发现的数量较少，如前所述。
表2 志愿者的粪便微生物群组成
在含有YC、YP、YPF和FOS的培养基中，经过8、12和24 h的结肠发酵后，检测(目标)菌群与阴性对照的相对差异结果见图2，统计结果见表3阴性对照相比，山羊酸奶制剂在24 h的结肠发酵过程中显著增加了乳酸菌的数量(P < 0.05)。另一方面，与阴性对照相比，FOS在结肠发酵8和12 h后未引起乳杆菌种群数量的增加(P≥0.05)，在结肠发酵24 h后仅略有增加。发酵8、12和24 h后，YC、YP和YPF组乳酸杆菌的数量增幅(137%~182%)均高于FOS组(0~26%)，尤以YP组为显著(142%~182%)。发酵24 h后，YC、YP、YPF和FOS使双歧杆菌种群数量较阴性对照增加15%~25%。
图2 在添加FOS、YP、YPF和YC的培养基中，不同肠道菌群在结肠发酵24 h期间与阴性对照的相对差异。(A)乳杆菌，(B)双歧杆菌，(C)瘦梭菌，(D)厚壁菌门，(E)拟杆菌门
从YC、YP、YPF、FOS和阴性对照培养基中检测到的细菌群DNA拷贝值(表3来看，在24 h的结肠发酵过程中，山羊酸奶配方和FOS对双歧杆菌种群的影响相似(P≥0.05)，显著高于阴性对照(P < 0.05)。FOS在大肠发酵24 h后才引起乳酸杆菌种群数量的增加(P≥0.05)，而YPF、YP和YC在大肠发酵8 h后就引起该种群数量的增加(图3)。
表3 在24小时的结肠发酵过程中，通过实时PCR获得不同肠道细菌群体的数值
图3 在含有FOS、YP、YPF、YC和C−的培养基中，肠道微生物群不同菌群的实时PCR DNA拷贝数。(A)乳杆菌，(B)厚壁菌门，(C)瘦梭菌，(D)拟杆菌门，(E)双歧杆菌
这些结果可能与乳酸菌的特点有关，即与双歧杆菌相比，乳酸菌对发酵底物的限制更大，而且对山羊酸奶配方中可用的某些特定营养物质(如氨基酸和肽)的要求更高。酸奶具有典型的优良蛋白质组成，这可能是YPF、YP和YC对乳杆菌种群产生显著积极作用的原因。蛋白质和碳水化合物的结合可能有助于肠道健康，因为膳食蛋白质中的氮对碳水化合物代谢和肠道微生物群生长至关重要在YP和YPF中分别发现的酚类化合物(2.99和4.37 mg/100 g)和纤维(25.07和76.70 mg/100 g)(表1)可能是这些酸奶配方发酵培养基中乳酸杆菌和双歧杆菌数量增加的原因。酚类化合物和纤维与人体肠道菌群中乳酸杆菌和双歧杆菌的刺激作用有关。乳杆菌和双歧杆菌是对宿主肠道健康有多种益处的菌群。形成人体肠道菌群的许多细菌群，包括双歧杆菌和乳杆菌，都表现出参与酚类化合物分解代谢的β-葡萄糖苷酶活性。膳食纤维也可以被这些细菌群代谢，产生短链脂肪酸(SCFAs)并诱导肠道微生物群的正向调节。
厚壁菌门包括乳杆菌群和瘦梭菌群。在24 h的结肠发酵过程中，YC、YP、YPF和FOS使瘦梭菌的种群数量较阴性对照略有增加(4%~17%)(图2和表5)。从DNA拷贝数数据(表5)来看，阴性对照和添加YC、YP和FOS的培养基中leptum的初始和最终种群数量没有差异(P≥0.05)。C. leptum是厚壁菌门的主要菌门，占总肠道菌群的16%~25%，此外还与炎症性肠病的抑制有关。
与阴性对照相比，YC、YP、YFP和FOS对厚壁菌群的影响很小(0~12%)(图2)，在结肠发酵的24小时内，该群体的影响没有显著增加(P≥0.05)(表5)。即使山羊酸奶配方在结肠发酵期间对乳酸菌种群有很高的积极影响，这些影响没有扩展到厚壁菌门，可能是因为乳酸杆菌是人类肠道微生物群的少数群体之一(约占2%)。
在大肠发酵12 h和/或24 h后，与阴性对照相比，YC、YP、YPF和FOS使拟杆菌门种群数量略有下降(4%~25%)(图2)。然而，根据DNA拷贝数数据(表5)，在大肠发酵24 h期间，FOS和阴性对照使拟杆菌门种群数量增加(P< 0.05)，而YC、YP和YPF对该门的初始种群和最终种群数量无差异(P≥0.05)。这些结果很重要，因为拟杆菌门是拟杆菌门的主要类群，而该类群中的一些物种与对宿主健康的有害影响有关，例如增强毒素形成和致病性。众所周知，葡萄纤维和酚类化合物对肠道微生物群有积极作用。虽然与YP相比，YPF显示出更高的纤维和酚类化合物值，但两种配方对结肠微生物群的影响相似。这些结果表明，YP和YPF之间纤维和测定的酚类化合物浓度的差异不足以引起测量的细菌种群的显著差异。
厚壁菌门和拟杆菌门的DNA拷贝结果用于测定结肠发酵8、12和24小时后的F：B比(图4)。厚壁菌门和拟杆菌门是数量最多的门，约占人类结肠微生物群总数的90%。维持厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度应该比刺激其种群增加更重要。在健康个体中，F：B比值通常接近于1，而急剧上升(如达到20：1)或下降分别与肥胖和体重减轻有关。所研究的山羊酸奶配方，特别是YP和YPF，在24 h的结肠发酵过程中使F：B比维持在1附近，这可能是重要的结果，表明这些配方能够维持厚壁菌门和拟杆菌门的种群，而对F：B比的总体影响很小。
与阴性对照相比，在24小时的结肠发酵过程中，所测细菌群的数量差异很好地代表了受食品样品或成分影响时的结肠微生物群行为，这表明所检测的山羊酸奶配方对人类肠道微生物群组成具有总体积极影响。此外，对乳酸杆菌和双歧杆菌种群的特异性刺激作用表明，所检测的山羊酸奶配方对人类结肠微生物群具有选择性刺激特性，这应该是表征益生元效应所需的标准之一。
图4 在含FOS、YP、YPF、YC和C−的培养基中，24 h菌落发酵F：B比值值评估
山羊酸奶配方对结肠菌群代谢活性的影响
YC、YP、YPF、FOS和阴性对照培养基在结肠发酵8、12和24 h后的pH值、糖和有机酸含量结果见表4在所检测的山羊酸奶配方和FOS培养基中，pH值在24 h的结肠发酵过程中呈下降趋势，而阴性对照没有变化(P≥0.05)。结肠中pH值的降低可以被认为是细菌发酵与SCFAs产生相关的指示物。这种关系可以通过在所检测的山羊酸奶配方和FOS培养基中结肠发酵过程中有机酸含量的增加来证实。
表4 发酵过程中pH值、糖和有机酸含量
YP、YFP和FOS培养基中果糖含量相近(P≥0.05)。添加YC、YP和YPF的培养基中乳糖含量较高，以添加YC的培养基中初始乳糖含量最高(P < 0.05)。这些结果应该是意料之中的，因为YP和YPF中伊莎贝尔葡萄成分的存在应该会降低这些酸奶配方中牛奶化合物(如乳糖)的浓度。在山羊酸奶配方的培养基中发现葡萄糖，可能是由于乳糖被细菌分解。在24小时的结肠发酵过程中，这些糖几乎或完全被代谢，证实了它们作为底物被结肠微生物群利用。阴性对照中未发现果糖、葡萄糖和乳糖。
乳酸和乙酸在添加山羊酸奶和果寡糖的培养基中含量较高，在添加YP和YPF的培养基中含量基本一致(P≥0.05)。在结肠发酵过程中发现乳酸和乙酸含量增加。乳酸和乙酸是乳杆菌和双歧杆菌发酵代谢的重要产物，其含量的增加可能与山羊酸奶配方对这些细菌群产生的积极影响有关。乳酸是碳水化合物代谢的中间产物，肠道菌群通常利用乳酸生成其他有机酸。
由于一种微生物代谢的最终产物可能成为另一种微生物的底物，因此许多微生物之间可以相互作用，相互依赖，这是一种交叉摄食代谢。有些有机酸是发酵过程的中间产物，如乳酸和琥珀酸，很容易用于交叉饲养过程。乳酸可用于硫酸盐还原菌合成乙酸。琥珀酸可用于合成丙酸，主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成。丁酸可以用乙酸合成，在较低程度上，一些梭状芽孢杆菌在低葡萄糖浓度的培养基中也可以用乳酸合成。
大肠发酵培养基中琥珀酸、丙酸和丁酸含量较低，仅在发酵8或12 h时发现。这可能是因为琥珀酸、丙酸和丁酸可以通过以乙酸和乳酸为前体的代谢途径形成。乙酸、丁酸和丙酸均为短链脂肪酸，可被上皮细胞吸收并被宿主代谢，因其与提供健康益处的机制相关而得到认可。丁酸和丙酸与肠道生理和免疫功能的调节有关，而乙酸在脂肪生成和糖异生中作为底物。阴性对照的有机酸只有乙酸、丙酸和丁酸，但与其他发酵培养基相比含量较低(P < 0.05)。短链脂肪酸的产生与底物发酵的程度直接相关。结肠中SCFAs的存在与有益的健康效应有关，如改善免疫和抗炎反应，增加营养物质的生物利用度和抑制肠道病原体。
本研究的主要局限性可能是山羊酸奶样品的特性，因为难以接近模拟人类胃肠道消化过程中非常复杂的物理化学和生理事件;与主要由兼性厌氧细菌形成的粘膜表面微生物群相比，使用FI可能更能代表人类结肠腔中大多数严格厌氧细菌的微生物群;以及缺乏对作为肠道菌群一部分的其他微生物群(如瘤胃球菌)的测量。然而，本研究中使用的实验方案在评估不同食物或衍生物质对肠道微生物群的影响的早期调查中显示出一致的结果。
Conclusion
结果表明，YC、YP和YPF均能促进乳酸菌和双歧杆菌益生菌的生长和代谢活性，随着时间的推移，它们能诱导乳酸菌和双歧杆菌的活菌数增加，pH值降低，有机酸产量增加。经检测的山羊酸奶配方由人类结肠微生物群发酵，导致乳酸杆菌种群增加。和双歧杆菌，在结肠发酵过程中pH值降低，SCFAs产量增加。此外，与FOS相比，山羊酸奶配方对乳酸菌种群有更大的积极影响，尤其是含有伊莎贝尔葡萄成分的山羊酸奶。这些结果表明，从伊莎贝尔葡萄中提取富含纤维和酚类成分的山羊酸奶应该是一种对肠道微生物群和人类健康有积极影响的食品生产策略，除了是一种与零浪费农业工业和食品生产实践相关的方法之外。进一步的研究可以在体内评估摄入含有伊莎贝尔葡萄成分的山羊酸奶对肠道微生物群和与肠道健康或特定代谢紊乱相关的其他参数的影响。
Ingredients from integral valorization of Isabel grape to formulate goat yogurt with stimulatory effects on probiotics and beneficial impacts on human colonic microbiota in vitro
Francyeli Araújo Silvaa,*, Rita de Cássia Ramos do Egypto Queirogab, Evandro Leite de Souzab, Glenise Bierhalz Vossc, Maria Manuela Estevez Pintadoc, Margarida Angélica da Silva Vasconcelosa
a Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife 50670-420, Brazil
b Department of Nutrition, Health Sciences Center, Federal University of Paraíba, João Pessoa 58050-585, Brazil
c Universidade Católica Portuguesa, CBQF-Centro de Biotecnologia e Química Fina-Laboratório Associado, Escola Superior de Biotecnologia, Porto 4169-005, Portugal
*Corresponding authors.
Abstract
Isabel grape (IG) products have high contents of phenolic compounds and fiber recognized for their positive impacts on microorganisms associated with health benefits to host. This study evaluated the effects of goat yogurts formulated with ingredients from IG integral valorization on the growth and metabolism of different probiotic strains, as well as on the population of selected bacterial groups and metabolic activity of human colonic microbiota in vitro.Goat yogurts with IG ingredients (IGI) stimulated the growth of tested Lactobacillus and Bifidobacterium probiotic strains during a 48-h cultivation, as well as decreased the pH values and enhanced the organic acid production. Goat yogurts with IGI increased the population of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. during a 24-h in vitro colonic fermentation. A stable Firmicutes:Bacteroidetes ratio close to 1 was found in media with goat yogurt formulations during the colonic fermentation, being similar to the effect caused by fructooligosaccharides. Goat yogurt formulations with IGI caused increased production of short-chain fatty acids and sugar consumption during colonic fermentation. Goat yogurts with IGI should be a valuable strategy for development of novel added-value foods with beneficial effects on gut microbiota and human health.
Reference:
SILVA F A, DO EGYPTO QUEIROGA R C, DE SOUZA E L, et al. Ingredients from integral valorization of Isabel grape to formulate goat yogurt with stimulatory effects on probiotics and beneficial impacts on human colonic microbiota in vitro[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1331-1342. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.034.
翻译：李曦明（实习）
编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅
封面图片来源：图虫创意
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家肉类加工工程技术研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，贵州大学共同主办，贵州医科大学、清华大学深圳国际研究生院、河南省大鲵保护与发展协会支持协办，中国食品杂志社《肉类研究》杂志、《乳业科学与技术》杂志、《Food Science of Animal Products》承办，钛和中谱检测技术（厦门）有限公司、贵州油研纯香生态粮油科技有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、四川安好众泰科技有限公司、贵州成义烧坊酒业股份有限公司、贵州黔醉酒业（集团）有限公司、黔东南民生食品有限公司、贵州普安红茶业（集团）有限公司等企业赞助的“2023年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”即将于2023年10月28-29日在贵州贵阳召开。