近日，苏黎世联邦理工学院Jacob E. Corn团队在Nature Communications(IF:17.69)杂志发表题为：“Recursive Editing improves homology-directed repair through retargeting of undesired outcomes”的研究论文，他们开发出递归编辑策略(REtarget)，一种HDR改进策略，它可以根据InDel结果有选择地重新定位，以创造更多的机会来产生所需的HDR等位基因。通过使用他们提供的REtarget工具，能够合理设计递归编辑实验所需要的引物。在单个编辑反应中使用REtarget设计的引导RNA，递归编辑可以同时提高HDR的效率和减少不希望出现的InDel。他们还利用REtarget生成整个基因组中特别有效的递归编辑位点的数据库，对蛋白质进行内源性标记，并针对致病性位点进行突变。递归编辑是一种易于使用的方法，无需对细胞进行潜在的有害操作，也没有增加实验负担。
CRISPR-Cas诱导的同源性定向修复(HDR)能够借助外源供体模板介导广泛的精确基因组修饰。然而，HDR在人类细胞中的应用常常受到效率低下的阻碍，这是由于细胞内更倾向于非同源性末端结合(NHEJ)修复，一种易错修复模式，NHEJ修复会产生短插入和缺失。
为此，该团队开发出递归编辑策略，简单理解就是循环打靶，第一次靶向编辑之后会有一定概率实现HDR的目标编辑，但是也有副产物编辑，再以副产物编辑后的序列作为第二次靶向的位点再次进行HDR靶向编辑，以此类推(图1 a-b)。要怎么实现编辑结果预判呢？需要借助算法(有参考文献)，通过大数据分析编辑后的修复结果，会得出副产物编辑结果的比例，例如1 bp插入的概率为42.6%；5 bp 删除的概率为13.3%(图1-c)，然后根据这个结果设计第二级sgRNA，也即图示中的B1，B2等，再根据第二级的结果设计第三级的sgRNA，以此类推，最终的结果就是会提升HDR修复的比例，进而提高其编辑效率。体外的RNP实验结果表明此策略可以提升HDR的编辑效率(图1-d)，这种策略涉及到递送顺序的问题，是分次递送每一级编辑载体还是同时递送？为此，他们也做了相应的探索，发现同时传递的最大HDR频率(50.4 ± 7.7 %)低于顺序传递(62.7 ± 0.4 %)，不过，两者HDR效率都明显高于对照组(图1-f)
图1
该策略不仅适用于人类全基因组的靶向以提高HDR效率，还可以在蛋白质羧基端进行GFP标记，通过用两级递归编辑系统针对HIST1H2BJ，在K-562细胞中使用250-350bp同源臂的线性dsDNA供体，在有RNP B1的情况下，HDR大幅增加(2.77±0.53 %至10.28±0.46 %)(图2-a)。在没有供体存在的样品中，测序分析显示RNP A1有一个4bp的缺失，被RNP B1有效地耗尽(图2-b)。使用HIST1H2BJ的质粒供体也观察到GFP插入的增加，总体上HDR低于以前报道的线性供体(图2-a)。递归编辑在共同加入RNP B1后增强了GFP的插入，并在另外两个基因FBL和RAB11A中有效地重定向了主要的InDel(图2 a-b)。
图2
综上，该研究开发的递归编辑提高了HDR的编辑效率，有可能与更积极的HDR增强策略相结合，如供体修饰或Cas9融合，以进一步提高精确的编辑结果。通过利用无PAM的Cas9变体，如SpRY或结合其他核酸酶(如Cas12a)的潜在抑制点预测算法，可以扩大可用于递归编辑的目标空间。REtarget还拥有搜索任何用户定义的基因组序列的能力。总的来说，递归编辑可能是一个有用和有效的工具，在研究和临床环境中提高基因修饰的效力。