文 | Written by Rick
欢迎关注WX公众号：可研Plus
2022年9月20日，Plant Communications(IF:8.625)在线发表了电子科技大学张勇教授、马里兰大学戚益平教授和中国农业科学院生物技术研究所谷晓峰研究员的合作文章：“Hypercompact CRISPR-Cas12j2 (CasΦ) enables genome editing, gene activation, and epigenome editing in plants”。该文章检测了紧凑型Cas12j2系统在水稻，番茄和杨树中的工作效率，证实Cas12j2可以在植物中实现多基因编辑、介导基因转录激活以及介导DNA甲基化。
“前期探索性实验”。他们使用了一个高效的基于双Pol ll启动子的DNA表达系统来驱动Cas12j2表达(图1-A)，已有报道表明Cas12j2可以识别T-rich PAMs，在水稻原生质体的编辑结果表明与VTTTV PAM(V代表A/C/G)相比，Cas12j2更倾向于识别VTTV PAM(图1-B)；此外，他们对比了PAM为不同侧翼时的识别效率，NTTA、NTTC和NTTG均可以被识别，编辑效率最高可以达到25%，但是大部分NTTT PAM未能实现有效的编辑(图1-C)。以上实验结果表明Cas12j2倾向于识别NTTV PAM。
Cas12j2介导多基因编辑。他们通过使用Pol ll启动子和HH-HDV核酸酶系统(图1-D)，在水稻原生质体中有四个位点实现了高效编辑，编辑效率(15%-50%)(图1-E)；在番茄基因组中测试了16个VTTV PAM位点，其中12个位点检测到了不同的编辑效率(图1-F)；不管是在水稻还是番茄细胞中编辑结果几乎全是删除编辑(图1 E-F)；进一步分析表明，无论是在水稻还是番茄的靶位点，在PAM远端会出现频繁地删除事件(图1 G-H)，删除长度在7-13bp。
检测Cas12j2的靶向特异性。sgRNA长度会影响识别效率，18bp及其更长一点的sgRNA可以保持高效识别，16bp和14bp长度的sgRNA会导致识别效率降低(图1-I)；当sgRNA出现错配时，在PAM远端的错配对于识别效率影响较小，当在sgRNA的1-14bp中引入两个连续的错配时，会直接导致识别失效(图1-J)。这些数据表明Cas12j2具有精确的识别能力。
对比不同Cas12j2变体的编辑效率。nCas12j2在一些位点的编辑效率显著提高，vCas12j2具有和野生型Cas12j2相似的编辑效率(图1-K)。这表明通过改进Cas12j2的蛋白结构可以提升系统的编辑效率，在植物中nCas12j2更适合于用来做基因编辑。
评估Cas12j2在稳转植物中的编辑效率。很有意思的是，虽然T0株系中Cas12j2的mRNA表达量正常，但是却只能检测到非常低的编辑效率，这表明Cas12j2在稳定株系与原生质体中的编辑是脱节的，说明Cas12j2只能在未分化细胞中具有高效编辑，比如原生质体，也说明可以通过原生质体的再生获得高效的Cas12j2的编辑。
Cas12j2介导的转录激活。TV激活域结合Cas12j2系统即可实现转录激活(图1-L)，在测试的两个基因中，均未发生基因编辑(图1 M,P)，但在两个基因位点的原生质体中分别实现了4倍和2倍的转录激活活性(图1 N,Q)，在稳转植株中两个基因位点可以分别实现10倍和4倍的转录激活活性(图1 O,R)。
Cas12j2介导的表观基因编辑。采用先前CRISPRoff的配置，引入DNA甲基化酶(图1-S)，在OsGBSS1基因的启动子区域设置四个靶点(图1-T)，甲基化编辑之后，OsGBSS1基因表达的mRNA显著降低，通过BS-PCR进一步证实确实实现了启动子区域的甲基化。
图1
综上，该文章系统地评估了Cas12j2的PAM识别能力、识别精准度以及在植物中介导不同编辑活动的效率，为Cas12j2在植物中的进一步应用提供了参考。
如转载，请标明来源！