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2022年9月15日，Molecular Therapy杂志(IF:12.9)在线发表了韩国蔚山大学医学院Yongsub Kim团队题为“Targeted genomic translocations and inversions generated using a paired prime editing strategy”的论文。他们开发了Prime editor核酸酶介导的易位和倒位策略(PETI)，这是一种使用Prime editor 2核酸酶(PE2核酸酶)和成对的pegRNA进行可编程染色体易位和倒位的方法。使用PETI方法，成功地在荧光报告系统中引入了DNA重组以及应用PETI方法在人类细胞中创造了癌症相关的易位和倒位，研究结果表明，PETI以可编程的方式产生染色体易位和倒位，效率与Cas9相当。
值得特别注意的是，该策略中PE系统用的是核酸酶，也即具有DNA双链切割活性，产生双链断裂，再配合双pegRNA，以此来介导染色体重组、易位与倒位。
首先是在体外的荧光报告系统中验证了PETI策略可以正常发挥作用，实现了DNA的重组，随后进行了人类内源基因的染色体易位实验。选择了HEK3和HEK4两个基因中的位点(图1-a)，易位后会产生两个连接点，转入对照质粒以及PE2+双pegRNA，深度测序后发现，相对于Cas核酸酶，PE2核酸酶产生了更加精确的编辑结果(PE2:43.9% & 23.9%; Cas9:11% & 0%)(图1 b-d)，随后测试了同时删除或者插入碱基的编辑效率，结果显示，相较于Cas9核酸酶，PE2核酸酶的编辑同样是更加精准(图1 c-d)。在介导易位过程中还会产生其他不需要的编辑结果(图1-e)，PE2核酸酶可以提高精确编辑的比例，降低不需要编辑的比例(图1-f)。这些结果表明，具有适当成对pegRNA的PE2核酸酶可以诱导人类细胞连接处带有所需突变的相互易位，以及证明了PETI策略可以产生比Cas9核酸酶更精确更纯的染色体易位编辑。
图1
使用PETI生成癌症相关的染色体易位。由染色体易位或倒位诱导的ALK基因融合可导致各种类型癌症的发展，本次利用PETI策略诱导产生NPM1-ALK和KIF5B-ALK两种易位(图2 a-b)，相关处理之后，深度测序发现PETI在NPM1-ALK和KIF5B-ALK连接处诱导了显着更高比例的所需易位(图2 c-e)。为了进一步了解这些结果，使用了多重PCR，揭示了PE2核酸酶以PETI引导的方式诱导精确易位，并与Cas9核酸酶相比减少了不希望的易位(图2-f)。
图2
使用PETI生成癌症相关的染色体倒位。人类癌症中最常见的致癌染色体重排之一会导致EML4-Alk融合蛋白的表达，有几种不同的倒位类型(图3 a-b)，利用PETI尝试诱导产生EML4-Alk倒位，测序结果显示，相较于Cas9核酸酶，PETI产生的正确倒位和具有预期插入的倒位的比率更高(图4 c-d)。使用多重PCR和深度测序来确定倒位的相对频率，发现PE2核酸酶产生的频率在三种EML4-ALK倒位中明显高于Cas9（图4e）。这些结果表明，PETI可高频和高保真度地产生与癌症相关的倒位。
图3
综上，PETI策略可以高效介导的染色体的易位与倒位，为基因功能研究提供了可以选择的高效工具。
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