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2022年9月8日，Nature Biotechnology(IF:68.16)在线发表了Broad研究所David R.Liu和波士顿大学Ahmad S. Khalil合作的文章：“High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs”。他们利用噬菌体辅助的非连续进化和eVOLVER支持的噬菌体辅助连续进化，将Nme2Cas9(一种紧凑的Cas9变体)进化成识别单核苷酸嘧啶-PAM序列的变体，解决了目前高活性Cas9变体不能识别富含嘧啶PAM的难题。他们本次进化出四种高活性变体eNme2-T.1，eNme2-T.2，eNme2-C和 eNme2-C.NR。变体 eNme2-T.1 和 eNme2-T.2 可以识别 N4TN PAM，编辑效率与现有变体相当；eNme2-C和 eNme2-C.NR 提供的PAM要求限制性较小，在各种人类细胞类型中具有可比或更高的活性，并且在N4CN PAM序列中具有更低的脱靶效应。
Cas9结合的靶位点必须包含原间隔邻接基序(PAM)，该邻近基序在单向导RNA(sgRNA)结合之前通过蛋白质-DNA相互作用被识别。这种PAM要求对于实现精准编辑影响很大，无合适PAM时导致不能进行精准的基因编辑，例如碱基编辑器或者PE系统不能在目标位点进行突变，限制了精确基因编辑方法的适用性。不同研究者已经探索过多种Cas变体以期突破PAM的限制，不幸的是，与SpCas9相比，大多数这些天然同源蛋白的表征较差，在哺乳动物细胞中的活性较低或具有高度限制性的PAM要求，限制了它们在精准基因编辑应用中的使用。因此，非SpCas9同源蛋白的工程或进化并不常见，只有少数报告的例子。
为了解决上述难题，他们选择了Nme2Cas9进行探索，Nme2Cas9是来自Neisseria meningitidis的 Cas9 变体，是一种有吸引力的 Cas9 同源蛋白，用于改进PAM兼容性。野生型可以识别N4CC PAMs，因此可以作为SpCas9变体以前无法识别嘧啶PAMs的有希望的进化起点。此外，Nme2Cas9的尺寸比SpCas9小(1082aa VS 1368aa)，使其对未来的输送应用具有吸引力。已有的研究也证明Nme2Cas9在哺乳动物细胞中也显示出强大的活性，既是核酸酶又可应用于碱基编辑器
前期准备工作--开发SAC-PACE进化系统
Nme2Cas9，以及更广泛的II-C型Cas变体，相对于SpCas9，可能具有较慢的核酸酶动力学，这种较弱的核酸酶活性归因于较慢的Cas9解旋活性。因为扩大PAM兼容性的一个主要动机是提高需要DNA解旋的基因编辑技术的适用性，所以选择保留或改善R环的形成、维持和核酸酶的激活至关重要。这些特性又和PAM交互区域(PID)密切关联。因此这就导致以DNA结合进化的PACE方法和PID工程化改造不适用于Nme2Cas9的进化(图1-a)。
新的筛选策略结合了DNA结合选择和碱基编辑选择两种策略，其中筛选噬菌体中含有待进化的Cas变体，但是没有繁殖活性，不能表达gIII基因；在大肠杆菌中具有辅助质粒(AP)，辅助质粒gIII基因中间插入了一个内含子(Npu)，该内含子中间又插入了可以编程的PAM-sgRNA，其中sgRNA中又插入了终止密码子，至此筛选通路形成，只有识别特定PAM以及完成终止密码子恢复，才能正常表达gIII基因，使得噬菌体可以正常复制繁殖(图1-b)。创新的地方在于他们借助了内含子的剪切功能，此前他们已经证实在gIII基因的Leu 10之后插入Npu内含子经过后续的反式剪切后不影响噬菌体进行强势地繁殖。
利用Nme2Cas9的原本识别PAM进行了测试，发现噬菌体可以实现最高10的6次方的繁殖(图1-c)，这表明该SAC-PACE(sequence-agnostic Cas-PACE)选择是一个高度灵活的系统，可用于改进Cas变体的PAM范围。
为了在定向进化时实现更大的吞吐量，他们开发出ePACE系统，该系统是将PACE的连续诱变和选择与高度可扩展、可定制和自动化的eVOLVER连续培养平台相结合得到的(图1-d)。ePACE可以同时在八个不同的PAM(或其他选择条件)上同时执行PACE实验。鉴于PACE实验通常需要1-2周，与传统的单贮留池PACE相比，通量增加8倍意味着实验时间缩短了2-4个月，成本降低了10倍。
图1
前期准备工作--开发BE-PPA分析系统
为了快速评估新进化出来的变体的PAM特性，他们开发了一种碱基编辑依赖性PAM分析测定法(BE-PPA)。在BE-PPA中，含有靶腺嘌呤(ABE-PPA)或胞嘧啶(CBE-PPA)的sgRNA或sgRNA文库安装在PAM序列库的上游。该文库与表达感兴趣的碱基编辑器的质粒一起转化为大肠杆菌。由于每个PAM的碱基编辑是独立于其他PAM测量的，因此与基于核酸酶的测定相比，BE-PPA具有更高的灵敏度。
图2
高严格策略进化识别N4CN的Nme2Cas9变体
前期进行了低和中度严格性进化，ePACE1和ePACE2的结果显示，在N4TN PAMs上活性的提高伴随着N4CN PAMs上活性的扩大，因此最终改进得到了高严格进化策略(图3-a)。
使用ABE-PPA检测的16个ePACE4克隆表现出强大而普遍的ABE活性，在所有N4CN PAMs中平均编辑率为66%。特别是eNme2-C作为ABE8e系统变体在所有N4CN PAM位点实现了≥80%的A-T到G-C编辑，与Nme2-ABE8e相比，在N4CD PAM位点上的活性平均提高了4.8倍，甚至在野生型Nme2Cas9天然识别的N4CC PAM位点上的活性平均提高了1.3倍(图3 c,d)。在HEK293T细胞中，观察到eNme2-C-ABE8e在先前测试的所有八个内源性人类基因组N4CN位点上具有强大的ABE活性。值得注意的是，与Nme2-ABE8e相比，eNme2-C-ABE8e在N4CC PAM位点上的平均编辑效率高出2.0倍，在N4CD PAM位点上的编辑效率高出15倍，与早期进化的变体eNme2E1-2-ABE8e和eNme2E2-12-ABE8e相比，在所有位点上的编辑效率分别提高2.3至3.3倍(图3-e)。eNme2-C-ABE8e的编辑窗口大约在sgRNA第9和16位之间(将PAM算作第24-29位)，与Nme2-ABE8e的编辑窗口相似。以上数据表明，eNme2-C-ABE8e是一个强大的腺嘌呤碱基编辑器，可以识别N4CN PAMs。
高严格策略进化识别N4TN PAM的Nme2Cas9变体
使用ABE-PPA，观察到ePACE5变体表现出广泛的PAM兼容性，识别特性与ePACE4变体相反。虽然N4TN的活性是最丰富的，但在所有其他PAMs都观察到大量的腺嘌呤碱基编辑活性，这可能增加下游Cas依赖的脱靶编辑。eNme2-T.1eNme2-T.2在所有N4TN PAMs中显示出>70%的平均A-T到G-C的编辑(图3-f)。在HEK293T细胞中对eNme2-T.1和eNme2-T.2变体在之前测试的八个内源性人类基因组N4TN位点进行测试，在这八个位点上，eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e的平均A-T到G-C编辑率分别为23%和22%，比野生型Nme2-ABE8e的活性提高了278倍和264倍(图2-g)。
在包括八个额外的基因组N4TN位点后，eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e分别在16个总位点中的69%和63%表现出超过1%的碱基编辑效率。在显示碱基编辑率大于1%的位点中，eNme2-T.1-ABE8e的效率在1.4-51%之间，eNme2-T.2-ABE8e的效率在1.4-50%之间。与eNme2-C-ABE8e相比，这两个变体似乎都有一个略微5′偏移的碱基编辑窗口，在原生质粒的第7和12位之间(将PAM算作第24-29位)，但显示出类似的原生质粒长度偏好，即23个碱基对。eNme2-C、eNme2-T.1和eNme2-T.2一起提供了可以识别大量富含嘧啶的PAMs的机会，这些PAMs基本上是SpCas9衍生的变体无法访问的。
图3
eNme2变体和其他Cas变体的编辑性能的对比
目前还没有能够针对单一嘧啶PAMs的天然Cas变体的报道，在工程Cas变体中，只有SpRY对一些NCN和NTNPAMs显示出活性。他们选择了PAM匹配的基因组位点来直接比较SpRY和eNme2变体的碱基编辑活性(图4-a)。在HEK293T细胞的14个匹配的含C的PAM位点，eNme2-C-ABE8e在腺嘌呤碱基编辑方面比SpRY有明显改善，平均47% VS 23%的A-T到G-C编辑；与高保真SpRY的ABE8e版本SpRY-HF1-ABE8e相比，这一差异更为明显(47% VS 15%的A-T到G-C编辑)(图4-b)。相比之下，在HEK293T细胞的8个匹配的含T的PAM位点，eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e的活性低于SpRY-ABE8e或SpRY-HF1-ABE8e(eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e为23%和22% VS SpRY-ABE8e和SpRY-HF1-ABE8e为35%和38%)(图4-c)。这些数据表明，eNme2-C为修饰含C的PAM位点提供了最佳选择，而eNme2-T.1和eNme2-T.2与现有的SpRY变体一起为针对一些含T的PAMs提供了新的选择
然后，测试了对Nme2Cas9的改进是否可以推广到其他依赖Cas9的编辑方式。在HEK293T细胞的六个PAM匹配的靶点上，eNme2-C-BE4表现出平均28%的C-G到T-A编辑，比SpRY-BE4和SpRY-HF1-BE4分别提高了3.2和4.8倍(图4-d)。尽管比eNme2-C-ABE8e的效率低，但eNme2-C-BE4能够进行C-G到T-A的编辑，其水平与SpCas9或SpCas9衍生的CBE变体在其典型的含嘌呤的PAMs相当(在2倍以内)。
当RuvC失活突变D16A被逆转时，eNme2-C核酸酶在哺乳动物细胞培养中产生InDel的效率很低，在八个N4CNPAM位点平均只有2.1%的InDel(图4-e)。当逆转核酸酶和相关连接域的所有突变时，产生的变体eNme2-C.NR恢复了核酸酶活性，同时保留了新的N4CNPAM活性(在相同的八个部位平均34%的InDel)。然而，这些突变的逆转对ABE活性有负面影响，与eNme2-C.NR-ABE8e相比，eNme2-C-ABE8e表现出1.8倍的A-T到G-C转换。这些结果表明，RuvC/HNH结构域中的一些或所有的突变对eNme2-C变体的稳健的碱基编辑很重要，但同样的突变，如果存在，对eNme2-C.NR核酸酶的后续激活或催化活性是不利的
在建立了eNme2-C的碱基编辑或DNA裂解的两个不同的亚变体后，接下来比较了eNme2-C.NR核酸酶与SpRY和SpRY-HF1核酸酶。SpRY和SpRY-HF1核酸酶在测试的NCNPAM匹配位点上的效率都比较低，被eNme2-C.NR核酸酶明显超越(eNme2-C.NR核酸酶的编辑效率分别提高3.4和7.3倍)(图4-e)。这些数据突出了eNme2-C碱基编辑和eNme2-C.NR核酸酶是基因组编辑的高效变体，在需要获得含C的PAM的应用中，为SpRY和SpRY-HF1提供了很好的替代方案。
图4
后续评估了脱靶效应，eNme2-C-ABE8e和eNme2-C.NR保留了Nme2Cas9的高自然特异性，并提供了比SpRY和SpRY-HF1同类产品更强的特异性，特别是对于精确应用，如碱基编辑。在实际应用中，数据表明eNme2-C是一种广泛适用的Cas蛋白，能够在多种生物相关的细胞类型中进行精确的基因组编辑；eNme2-C能够研究和纠正以前无法获得的致病性SNP。
这真是开发SAC-PACE和BE-PPA筛选与评估系统送高效Cas9变体，还是识别嘧啶PAM的Cas9变体，相信这种高效实用的定向进化策略以及进化出的eNme2-T.1，eNme2-T.2，eNme2-C和 eNme2-C.NR会在后续的科研探索中大放异彩！
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