近日，知名预印版杂志bioRxiv在线发表了庆尚国立大学植物分子生物学和生物技术研究中心Jae-Yean Kim课题组题为“CRISPR/Cas-based precision gene replacement in plants via homologous recombination-independent approaches”的研究论文。他们采用微同源介导的末端连接(MMEJ)方法实现了植物基因组的精确替换。MMEJ介导的精确基因替换比cNHEJ产生更高的靶向编辑效率，在番茄，生菜和卷心菜中分别高达8.89%，4.47%和8.98%。
该策略采用两个靶位点，这样就可以预测双链DNA的切口位置（PAM前3-4位间）。两个预测的切割位点之间的序列被用作供体模板，供体模板DNA序列可以插入目的突变序列，使其能够实现靶向碱基变化，同时可以避免基因替换后复发性切割。在MMEJ介导的编辑的情况下，侧翼DNA序列充当同源序列（图1）。
图1 微同源末端介导同源重组
首先在番茄原生质体中做了对比实验，目标突变6对碱基对（图2-a），比较了同源末端和非同源策略，结果显示同源末端策略可以实现2.46%的编辑，非同源末端策略仅实现0.09%的编辑；对同源末端介导的统计结果发现，实现6对目标编辑的效率高达9.72%（图2-b）；供体剂量会影响MMEJ介导的编辑效率，其编辑频率会随着供体剂量的增加而导致所有碱基变化频率增加（图2-c）；有效的微同源性长度（8-20个碱基）同样会影响编辑效率，当微同源性短于20 bp时，总编辑效率从4.22±0.47%(MJ.HPAT3-1)降至2.33 ± 0.31 % (MJ.HPAT3-2)和2.65±0.58%(MJ.HPAT3-3)（图2-d）
图2
后续他们在生菜和卷心菜中做了探索，采用两端含有20碱基微同源序列。在生菜中，MMEJ介导的精确编辑在LsALS1基因位点实现最高4.47%的编辑效率；在卷心菜中，在BoTT1位点获得最高的精确编辑效率（7.27±4.46%）。
综上所述，他们成功地运用MMEJ介导的策略实现了植物中的精确基因替换。然而，它需要进一步优化效率，特别是从编辑细胞中再生植物的效率。该报告提供了另一种精确的基因编辑工具，可能有助于推进未来的作物育种。
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