Introduction
凝结芽孢杆菌是一类具有高耐受性的芽孢杆菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的特点，已成为益生菌领域研究的热点。大量研究证明凝结芽孢杆菌的摄入有益人体健康，具有改善宿主营养吸收，调节宿主肠道菌群和免疫应答等功能。目前，凝结芽孢杆菌已应用于多种疾病的干预和治疗，包括便秘，急性腹泻和肠易激综合症。日本埼玉实验动物研究所通过基础饮食中补充60%酪蛋白造成大鼠便秘模型，补充凝结芽孢杆菌SANK 70258持续2周后，观察到大鼠粪便中双歧杆菌的含量显著增加，产气荚膜梭菌的数量显著减少，粪便气味减小，形状和颜色也得到改善，证实了凝结芽孢杆菌的缓解便秘功效。
然而，与其他芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌相比，凝结芽孢杆菌的基因信息挖掘处于落后状态。多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）技术是一种通过比较持家基因（Housekeeping gene）序列差异性，从而完成菌株分型的分子分型方法。与质粒指纹图谱分析、限制酶消化技术、扩增片段长度多态性分析技术（AFLP）、随机引物扩增DNA多态性分析（RAPD）等分子生物型分型技术相比，MLST分型技术具备简单快捷、重复性强、实验室数据共享的优势。研究者在进行菌株的多位点分析技术分析时，可参考和引用MLST数据库中已测菌株的等位基因编号和序列型，并上传新菌的序列，为后续研究者提供便利。
Results and Discussion
凝结芽孢杆菌MLST研究方案
通过下载数据库中已公布凝结芽孢杆菌ATCC 7050的全基因组核苷酸序列，对各基因序列进行比对，保守区域内选择7个相对保守的持家基因片段，并设计和验证了这些持家基因的PCR引物。其PCR扩增体系和条件详见正文。
凝结芽孢杆菌MLST分析结果
57株凝结芽孢杆菌共分为33个序列性（STs），被分为4个克隆复合体系（CCs）和9个独特型（Singleton）。等位基因的重组分析结果表明33个STs形成了3个遗传谱系（Lineage），同一谱系的菌株具有较近的同源性。其中，Lineage1包括16个ST型，Lineage2包括8个ST型，Lineage3包括9个ST型，每个谱系均存在较为复杂的网状结构（图1），表明菌株在进化中可能存在重组事件。以上结果说明，基因重组在57株凝结芽孢杆菌菌株多样性的产生中发挥重要作用。
（A）单个MLST等位基因的重组分解分析图；（B）17个等位基因综合的重组分解分析图。
图1 凝结芽孢杆菌持家基因重组分解分析
系统发育分析结果如图2所示，来自中国东部的大多数分离物被分配到CC1。然而，来自其他地理区域的凝结芽孢杆菌分散在所有CCs。因此我们推断凝结芽孢杆菌的进化与地理位置无关。此外，关联性分析也证明STs和分离源之间无关（详见正文）。
（A）不同凝结芽孢杆菌分离株的最小生成树图；（B）凝结芽孢杆菌的UPGMA 系统发育树图。
图2 凝结芽孢杆菌系统发育树分析
凝结芽孢杆菌对便秘小鼠的缓解作用
利用MLST分析结果，本文从系统发育树中的随机选择5株亲缘关系较远的凝结芽孢杆菌分离株评价了其对便秘小鼠的缓解作用。如图3所示，5株凝结芽孢杆菌处理组小肠推进率均显著高于模型组（P＜0.05），其中B.C-39组最高（72.12%），B.C-10组最低（49.24%）。本实验结果说明凝结芽孢杆菌促进便秘小鼠小肠转运的能力存在种内差异，其中B.C-39对小肠运动能力的改善效果最好，超过阳性药物酚酞和阳性菌株GBI-30。
（A）小鼠排首粒黑便的时间；（B）小鼠小肠推进率。不同字母a-f表示存在显著差异（P＜0.05）。
图3 小鼠的胃肠运输能力
菌群分析结果表明（图4），凝结芽孢杆菌增加了小鼠肠道内Bacillus的含量，其中B.C-39组最高，其次是B.C-70和B.C-71，这与其缓解便秘的效果正相关，说明凝结芽孢杆菌缓解便秘的效果与其在肠道中存活和定植能力相关。B.C-39能显著上调便秘引起的Allobaculum的减少，有研究表明该菌具有较强的碳水化合物利用能力，主要代谢产物为乳酸和SCFAs，该代谢物对便秘的缓解有重要作用。此外，灌胃凝结芽孢杆菌有助于抵抗便秘引起的Dehalobacterium和Adlercreutzia的减少，使其趋于正常组水平，研究表明Dehalobacterium相对丰度降低与炎症增加相关，Adlercreutzia增加有利于缓解肠易激综合征的病症。以上结果说明，补充凝结芽孢杆菌芽孢体后，芽孢可能通过在肠道中萌发、增殖，实现短暂定植，并通过代谢活动上调Allobaculum、Dehalobacterium和Adlercreutzia等有益菌的相对丰度，改善肠道菌群，从而达到缓解便秘的效果。
（A）小鼠肠道菌群在门水平上的组成；（B）小鼠肠道菌群相对丰度大于0.1%的属；（C）Bacillus相对丰度；（D）Allobaculum相对丰度；（E）Dehalobacterium相对丰度；（F）Adlercreutzia相对丰度。不同字母a-d表示存在显著差异（P＜0.05）。
图4 小鼠粪便中的微生物群组成
SCFAs含量增加可降低肠道pH值，抑制致病菌的生长，调节肠道微生态平衡；乙酸、丙酸可直接刺激肠壁蠕动，加速粪便排出；乙酸浓度增加可使肠管内渗透压增大，增加粪便对水分的吸收，达到润滑效果，帮助粪便转运。因此推测补充凝结芽孢杆菌B.C-39、B.C-70和B.C-71芽孢制剂可能通过增加肠道中SCFAs的产生，发挥缓解便秘的作用（表1）。
表1 不同凝结芽孢杆菌对小鼠粪便短链脂肪酸含量的影响
通过ELISA试剂盒测定小鼠血清中6种胃肠调节肽的水平（表2），发现模型组相比空白组表现出显著差异（P＜0.05）。所有凝结芽孢杆菌处理组血清中Gas、MTL和SP等兴奋性递质的水平均显著高于模型组（P＜0.05），抑制性递质VIP的水平显著低于模型组（P＜0.05），部分菌株对ET-1、SS的恢复程度不显著。B.C-39组对6种胃肠调节肽的调节能力均具有显著性，与阳性药物酚酞和阳性菌GBI-30相当。综合以上结果可以发现，便秘严重影响了小鼠体内胃肠激素的分泌水平，口服凝结芽孢杆菌芽孢微生态制剂，可抵抗便秘引起的胃肠调节肽的失调，且不同菌株的调节能力有差异，B.C-39表现出更好的调节能力，与其对便秘程度的缓解效果一致。本实验结果表明，凝结芽孢杆菌可能通过调节胃肠激素与神经递质的水平，发挥缓解便秘的效果。
表2 小鼠血清中胃肠调节肽的水平
基于基因组的分析发现凝结芽孢菌39对便秘的特殊缓解可能与碳水化合物利用及短链脂肪酸产生相关功能基因（BC39_002778、BC39_001313和BC39_003474）有关（表3），详见正文。
表3 凝结芽孢杆菌B.C39特定基因分析
第一作者
曹江，男，江南大学食品学院在读博士，主要研究方向为益生菌理论与技术及肠道微生物功能挖掘。在国内外期刊公开发表学术论文4余篇，其中SCI收录3篇。
通信作者
翟齐啸，男，江南大学食品学院教授、博士生导师，主要从事益生菌理论与技术及肠道微生物功能挖掘相关研究，以第一作者或通讯作者发表SCI科研论文83篇，获中国授权专利46项，国际授权专利6项。获江苏特聘教授、江苏省优秀青年基金资助和支持，主持国家自然科学基金青年、面上，国家十三五重点研发计划子课题等科研项目8项，获国家技术发明奖二等奖、中国专利奖金奖等国家与省部级奖励5项。兼任 Food Science and Human Wellness副主编、 Engineering、《乳业科学与技术》编委等职务。
MLST analysis of genetic diversity of Bacillus coagulans strains to evaluate effects on constipation model
Jiang Caoa,b,Wenyin Liua,b, Ruolan Liliua,b, Jianxin Zhaoa,b, Hao Zhanga,b,c,d, Wei Chena,b,c, Qixiao Zhaia,b,*
a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
c National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
d Wuxi Translational Medicine Research Center and Jiangsu Translational Medicine Research Institute Wuxi Branch, Wuxi 214122, China
*Corresponding author.
E-mail address: zhaiqixiao@sina.com
Abstract
Bacillus coagulans can help ameliorate or prevent gastrointestinal diseases, but the genetic relationships among B. coagulans isolates are not well studied. Multilocus sequence typing analysis was conducted on 57 isolates of B. coagulans from 22 provinces or autonomous regions in China. B. coagulans isolates were highly diverse and a total of 33 (sequence typings) STs were found. These isolates had a weak clonal population structure and strong indications of intraspecies recombination. The evolution direction of B. coagulans was not correlated with geography or isolation source. Fifteen strains were selected for further analysis based on proximity relationships from the phylogenetic tree. Five isolates (B. coagulans-1, B. coagulans-10, B. coagulans-39, B. coagulans-70 and B. coagulans-71) with good spore-forming ability relative to the rest of the isolates were evaluated for constipation relief. B. coagulans-39 significantly relieved constipation symptoms in mice by regulating intestinal flora, increasing the production of short-chain fatty acids and restoring the level of gastrointestinal regulatory peptides. Comparative genomic analysis showed the beneficial effects of B. coagulans-39 might be associated with specific functional genes that are involved in the utilization of various carbohydrates as primary substrates and short-chain fatty acid production.
Reference:
CAO J, LIU W Y, LILIU R L, et al. MLST analysis of genetic diversity of Bacillus coagulans strains to evaluate effects on constipation model[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(4): 815-827. DOI:10.1016/j.fshw.2022.03.014.
编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅
封面图片来源：图虫创意