“这是我们实验室利用对多肽翻译后修饰的调控，通过调控多肽分子的多阶段自组装，从而控制活细胞内特定位置多肽纳米凝胶形成的最新进展，有望用于蛋白递送、核酸递送和精确控制细胞行为等，” 9 月 14 日，西湖大学理学院博后杨雪娇告诉 DeepTech，这是此类试验在全球范围内的阶段性成果。
图 | 杨雪娇在西湖大学 2020 年新年晚会上（来源：受访者）
杨雪娇来自该校理学院独立 PI 王怀民研究员的团队，在该研究中他们利用化学手段，精确控制活细胞中多肽纤维凝胶的形成，借此即可发展功能性高阶结构的普适性策略。
图 | 杨雪娇导师王怀民的团队（来源：受访者）
9 月 2 日，在开学季的第二天，该研究以论文形式发表在权威化学期刊 Angewandte Chemie 上。
论文标题为《通过酸催化水解和酶促反应控制多肽组装体在活细胞内的合成》（Spatiotemporal Control over Chemical Assembly in Living Cells by Integration of Acid Catalyzed Hydrolysis and Enzymatic Reaction），其中杨雪娇担任第一作者，王怀民担任通讯作者。
活细胞内精确形成分子组装体仍然具有挑战性
该研究要解决的问题在于，近年来科学家对控制分子在细胞中组装已经取得了相关进展，但是精确控制化学组装在复杂生物体中的发生时间和位置，仍然面临诸多挑战。
一方面，物质分子进入细胞时，需要多种细胞成分的共同作用，而目前很难去控制分子在特定位置刺激因素条件下进入特定细胞部位（如细胞器）。
另一方面，当分子进入特定细胞器时，如何达到组装浓度并形成有序的组装结构，也未得到解决。
在活细胞中，分子自组装是一种构建具有合适空间结构的大分子核心技术。作为一种制造复杂结构的方法，它广泛存在于自然界中，并应用于超分子化学、材料科学和药物化学。
让分子基元组装成纳米结构时，通常会使用 pH 调节、有机溶剂辅助、光照射、超声、加热等外部刺激。
虽然在细胞外控制组装体和合成方面，科学家已取得了令人兴奋的成果，但这些策略很少通过原位自组装在细胞内应用，特别是在活细胞中。
在自然界的催化反应中，酶是重要的生物大分子。在活细胞中，酶的位置和活性可被生物体精确控制，从而来维持细胞功能，比如细胞增殖、分化、迁移和代谢等。
在过去几年里，用酶来诱导小分子在活细胞中发生原位自组装，已成为控制细胞行为的有效策略之一。
以最近备受关注的磷酸酶为例，在癌细胞中它们具有过表达、以及较低的内在底物等特性，这让其成为一种颇受欢迎的诱导自组装的酶。
尽管在酶诱导的自组装构建纳米结构中，科学家们已经取得了一定成就，但精确形成分子组装体仍然具有挑战性。
这是因为细胞内自组装所需的前体分子，会不可避免地被水解酶水解，甚至会在非必要的时间和位置上形成纳米结构。
而溶酶体被认为是细胞外和细胞内的材料 “回收中心”。近年来，人类对溶酶体功能和功能障碍的探索显示，靶向溶酶体正成为治疗癌症的新方法。但是，控制活细胞催化生成化合物的难题仍未得以解决。
基于此，该团队开发出一款高效且通用的平台，它的名字叫 化学可控组装，该平台可对活细胞中的组件形成，进行精确且高效的控制。
通过活细胞多阶段自组装，实现控制特定位置的纳米纤维形成
为证明该成果的可行性，该团队先是利用溶酶体的酸性环境，去除掉保护基团。接着，溶酶体中的酸性磷酸酶可对纤维水凝胶的原位自组装进行诱导。
最终，他们研发出一种简便有效的策略，该策略可在多肽分子的多阶段自组装中，精确控制组装体形成的位置。
（来源：受访者）
给多肽分子加一个 “刹车片”
首先，需要合理设计多肽分子。多肽分子进入特定细胞器之前，必须保证它不会被细胞膜或细胞质基质中的酶所水解，这样就必须给多肽分子加上一个 “刹车片”；而当它进入特定细胞器时，“刹车片” 必须脱落，从而让组装序列暴露，进一步在细胞器内发生组装。
其次，将多肽分子与不同种类的细胞共孵育，通过激光共聚焦显微镜和生物电镜，来验证该方法的可行性。
最后，扩充多肽分子的序列和细胞种类，以证明这种平台的通用性。
有望用于蛋白递送、核酸递送和药物运送等
研究人员告诉 DeepTech，这种可在时空上控制生命系统的化学组装，有望在蛋白递送、核酸递送、药物运送等领域产生重要潜在应用。
比如，可以给特定蛋白或药物加上 “刹车片”，从而实现无论在细胞外、还是在细胞质基质中，它们的结构和活性位点都不会遭到破坏。
如此一来，特定蛋白或药物就能被靶向运输到特定细胞器中，这时就能保持蛋白活性或药物疗效。
在材料科学中，还可对材料组成部件的开关进行调控，从而去精准控制材料功能。由于该团队的设计分子可以被特定酶识别，因此在化学生物学领域，可给研究细胞内特定酶的活性、以及筛选酶特异抑制剂带来重要帮助。
（来源：受访者）
可普遍用于活细胞内位点特异性分子的组装
概括来说，该研究揭示了多肽分子在酸催化水解后的排列转化，进一步证明了组装体的形成是一个多阶段自组装过程。 而纤维结构的逐渐增加，表明溶酶体中的组装需要时间积累，而非由溶酶体进行自发组装。
他们还在细胞质中观察到荧光，这表明随着培养时间的增加，组装物可以从溶酶体中逃逸。 此外，溶酶体中的荧光组装体也会传递给新的分裂细胞，这进一步证明了细胞分裂不受形成的自组装体的影响。
为进一步研究组装在细胞中的时间依赖性累积，研究人员使用流式细胞术，来表征活细胞中组装体的荧光。 结果表明，随着时间的增加，组装体的荧光强度逐渐增加，这表明细胞内组装体的形成具有时间依赖性。
（来源：受访者）
激光共聚焦扫描显微镜实验表明，自组装分子的荧光随着时间推移逐渐增加，这表明溶酶体中组装的积累是一个时间依赖性的酶促过程，而不是溶酶体中自发的自组装。
这些结果共同表明，在活细胞中，他们开发的位点特异性自组装策略具有生物相容性。
生物相容性的重要性在于，大多数磷酸化肽很难进入细胞，只能在细胞表面自组装，并且还含有细胞毒性，这会给它们在特定位置的生物学应用带来一定阻碍。
如下图所示，经过细胞反复传代，组装体的绿色荧光能和溶酶体示踪分子的红色荧光共同定位，这说明该团队的策略具有较强稳定性。以上试验综合证明，对翻译后修饰磷酸基团的特异保护在诱导活细胞中酶促可控组装起着关键作用。
（来源：受访者）
未来有望在活细胞中实现光照诱导的化学组装时空调控
总之，在可被酸性环境激活的条件下，该研究描述了一种控制酶的自组装的化学方法，并在体外和活细胞中原位进行自组装。
其中，酸的催化水解和酶诱导的自组装技术，可用于酸性条件下磷酰胺水解基团的任何情况。
对细胞裂解液中分子结构转变的分析，也证明了 Pro-1P-NMe 在人前列腺癌细胞中的多阶段自组装的发生，这意味着该方法可普遍用于调控活细胞内分子的特定位点组装。
此外，通过该研究建立的设计策略，也适用于其他通过取代酸催化的多肽序列和酶的类型，来构建控制特定位置的纳米结构形成的系统。
该研究还使用大量显微成像技术来对实验结果进行支撑。近年来，市面涌现出多类成像技术，可以实现细胞的超分辨率和高速观察。
（来源：受访者）
该团队告诉 DeepTech，对于显微成像技术的飞速发展，他们感到非常欣喜。显微成像技术对该工作也有非常大的帮助，期间帮助他们确定了多肽分子在细胞中的定位和组装。
未来，他们希望借助该技术对多肽分子在细胞中形成的结构，进行超高分辨率的观察，从而去确定细胞中的组状是否和体外结构类似。同时也希望观测多肽进入细胞及组装的整个过程，以便进一步确定相关机理。
另据悉，在体外实验中，多肽组装的调控因素包括pH值、温度、酶和光照等。目前，该团队希望在活细胞中实现光照诱导的化学组装时空调控，相关研究也正在进行中。
另外，在该研究中，他们选择了两种不同种类细胞，证明了该平台的通用性和高效性。如果有一天进行规模化生产，生物反应器或是不错的选择。
图 | 杨雪娇（来源：受访者）
今年 29 岁的杨雪娇，来自陕西渭南，本科毕业时分别拿到南开大学的理学学士学位、和天津大学的工学学士学位。后被保送直博到天津大学，博士毕业后来到西湖大学做博后研究。在即将来到的 10 月，杨雪娇即将博士后出站，届时她打算留在目前的课题组，并继续研究工作。
谈及即将成为西湖大学的研究员，杨雪娇告诉 DeepTech：“西湖大学是梦想扎根的土壤，我希望在这个富有创造力的地方，对肿瘤治疗和药物递送进行进一步深入研究，为疾病治疗贡献自己的力量”。
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