Introduction
发酵香肠通常由猪肉/牛肉、脂肪、盐和香料组成。在一定的温度和相对湿度条件下，发生复杂的反应，导致发酵香肠产生特定的颜色、质地和风味。但传统发酵香肠一般都是通过经验法进行自发发酵，因此产品的质量无法保证。
为了保证产品的安全性和质量的一致性，目前发酵香肠生产中普遍采用了发酵剂培养。肉类发酵剂主要由具有所需代谢活性的微生物组成。在发酵香肠中，乳酸菌（LAB）被认为是通过其抗菌代谢产物（包括有机酸、细菌素和过氧化氢）抑制病原体的最重要贡献者。凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）有助于限制脂质氧化和亚硝肌红蛋白的形成，其硝酸盐还原能力有利于典型红色的形成。一些葡萄球菌，如木葡萄球菌，也通过其蛋白水解和脂质分解活动参与香气的形成。在熟化过程中，蛋白质水解负责发酵肉的感官和营养特性。近十年来的许多研究表明，蛋白质水解不仅归功于肉类内源酶的活性，还与一些细菌群的活性有关，如葡萄球菌。但在肉类发酵过程中，葡萄球菌在蛋白质水解中的成功率受LAB的影响。因此，在筛选多菌种发酵剂培养物时，应考虑LAB与葡萄球菌之间的良好相互作用（无抑制或相互作用）。根据研究，木葡萄球菌与沙克乳酸杆菌的混合培养比木葡萄球菌单独培养对肌浆蛋白有更强的降解作用，说明微生物的相互作用与葡萄球菌的蛋白水解活性有一定关系。然而，混合培养发酵中微生物的相互作用及对葡萄球菌蛋白水解行为的影响，以及后续对发酵切片质量的影响一直被忽视。
从传统肉制品中分离出来的微生物由于对发酵肉的生态位有良好的适应性，有望用于肉类发酵剂的候选菌种。此外，从自发发酵中分离出来的LAB和CNS可能会根据其特殊的代谢活动提供独特而诱人的香气。侗族发酵酸肉是一种流行于侗族、土家族、苗族的中式发酵猪肉产品。自然发酵有利于本土微生物群的生长，提高了最终产品的微生物安全性和风味属性。因此，利用从侗族发酵酸肉中分离出来的细菌，可以合理地改善发酵肉（如发酵香肠）的感官特性和保质期。
为了获得蛋白水解发酵剂培养物，从侗族发酵酸肉中分离出具有蛋白酶活性的木葡萄球菌。中国肉类食品综合研究中心的Xi Chen、Shouwei Wang等在本研究中使用的LAB是从侗族发酵酸肉中分离出来的，基于混合培养物在体外的蛋白酶行为，开发了包括木葡萄球菌SX16和植物乳杆菌CMRC6的发酵剂配方。本研究旨在获得适用于生产发酵香肠的蛋白水解肉类启动剂，为适当选择多菌种发酵剂提供有用信息。
Results and Discussion
香肠的微生物学分析
图1显示了成熟过程中LAB、葡萄球菌和肠杆菌的微生物数量。发酵前（第0天），接种样品的LAB计数（＞5.15 lg（CFU/g））明显高于对照组（4.35 lg（CFU/g）），原因是其中含有植物乳杆菌CMRC6。发酵48 h后，CG（对照组）、LB（植物乳杆菌CMRC6接种组）和LS（植物乳杆菌CMRC6和木葡萄球菌SX16接种组）香肠的LAB生长出现爆发，分别达到7.51、9.13和9.05 lg（CFU/g）。在熟化过程中，对照组香肠的LAB数量明显低于用发酵剂发酵的香肠（P＜0.05）。证实了植物乳杆菌CMRC6的生长速度快，对发酵香肠环境的适应性好。
a.乳酸菌；b.葡萄球菌；c.肠杆菌。
图1 发酵香肠中的微生物活力计数
CNS有助于色泽和风味的发展。由于接种了木葡萄球菌SX16，LS发酵香肠的初始葡萄球菌数（5.10 lg（CFU/g））高于其他香肠（图1b）。发酵48 h后，CG香肠的葡萄球菌数量明显高于接种香肠，这可能是由于接种的自生微生物群酸化能力有限所致。该结果与许多报道一致，即强酸化会导致发酵香肠中对pH敏感的木葡萄球菌受到抑制。
肠杆菌通常被认为是加工过程中潜在微生物污染的生物标志物。如图1c所示，肠杆菌的初始水平约为2.8 lg（CFU/g）。在最初的48 h内，对照组香肠中的肠杆菌种群急剧增加（P＜0.05），达到5.28 lg（CFU/g），可能是由于自体LAB的酸化能力较低。相反，在熟化过程中，接种的香肠中发现肠杆菌的种群持续下降。LS接种香肠中的肠杆菌在熟化6 h后没有被检测到，说明多菌种发酵剂的竞争力很强。因此，所选择的多菌种发酵剂可以在熟化过程中主导微生物群落，通过抑制肠杆菌的生长来提高发酵香肠的安全性。
香肠的蛋白水解
用电泳法检测了肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解情况。图2显示了肌浆蛋白的概况。在接种的香肠中，成熟2 d后，约100 kDa的蛋白部分完全消失，这些香肠的肌浆剖面在成熟6 d后显示出35 kDa和55 kDa的条带完全降解。接种LS的样品在9 d后，约25 kDa的蛋白质部分消失，而接种LB的样品则在14 d后消失。这可能是由于发酵剂LS的蛋白水解活性更明显，主要对肌浆蛋白的降解产生影响。在熟化过程中，大分子蛋白的降解起源于接种香肠在熟化2 d后的15～25 kDa范围内的较轻蛋白组分。相反，CG组香肠的电泳图谱在成熟6 d后，除了15～25 kDa之间的条带强度增加外，没有出现明显变化。
a. CG香肠；b. LB接种香肠；c. LS接种香肠。泳道1～7表示成熟0、1、2、6、9、14和21 d的肌浆蛋白。
图2 肌浆蛋白在成熟过程中的电泳图谱
图3描述了肌原纤维蛋白的概况。在成熟期，肌球蛋白重链（MHC）部分在200 kDa左右的强度下降，在LS接种的香肠成熟6 d后完全消失，而LB发酵的香肠在9 d后该条带完全消失。在35～55 kDa范围内的肌动蛋白条带也受到不同的起始培养物的影响，因为LS培养样品在6 d后消失，而LB培养样品在9 d后消失。相比之下，对照组香肠中MHC和肌动蛋白组分的强度在成熟21 d后保持不变并略有下降。在成熟过程中，在所有配方处理中，25～35 kDa之间的蛋白质组分的强度增加，可能是因为源自MHC水解的肽的释放。
a. CG香肠；b. LB接种香肠；c. LS接种香肠。泳道1～7表示成熟0、1、2、6、9、14和21 d的肌浆蛋白。
图3 肌原纤维蛋白在成熟过程中的电泳图谱
在本研究中，用LB和LS发酵剂培养的香肠在成熟过程中表现出肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的相似蛋白模式，这可能是由于pH值下降激活了内源蛋白酶。事实上，在熟化过程中，LB和LS发酵香肠的pH值没有显著差异，导致两类香肠的内源性蛋白酶被激活，蛋白水解图谱相似。另一种解释可能是本研究中使用的处理时间较短（21 d）。据报道，内源性蛋白酶的作用在发酵开始时有助于肉蛋白的降解，而细菌蛋白酶在加工的后几个阶段发挥了重要作用。
挥发性化合物
经过21 d的熟化后，进行了挥发性化合物的鉴定和定量。在对照和接种香肠中共鉴定出50种挥发性化合物（图4），包括醇类（9种）、醛类（16种）、酮类（3种）、酯类（5种）、酸类（7种）、萜类（4种）、硫和氮化合物（4种）及其他（2种）。在发酵香肠中发现的大部分挥发物已被许多其他研究报道。本研究从挥发物最可能的来源研究，以了解发酵剂培养对香气生成途径的影响。然而，有些挥发物可能有多个来源，或者是来自不同代谢途径的物质之间二次反应的产物。近21%～52%的化合物来源于香肠制备中使用的黑胡椒等香料。本研究中发现的最丰富的辣椒萜类化合物是3-蒈烯。关于来源于脂质氧化的挥发物，己醛、壬醛、(Z)-2-庚烯醛、辛醛、2,4-癸二烯醛的数值在实验处理间有显著差异（P＜0.05），说明发酵剂对脂质分解和自氧化速率有影响。微生物酯化产生的挥发物可对发酵香肠的风味属性产生重要影响。在本研究中，含量最丰富的是乳酸乙酯，在不同处理中表现出显著差异（P＜0.05）。3-甲基-1-丁醇只在LS发酵香肠中发现，这可能是由于接种了木葡萄球菌SX16。这种化合物有助于增加风味的复杂性，主要来源于中枢神经系统对亮氨酸的分解作用。与肉葡萄球菌相比，木葡萄球菌产生的3-甲基-1-丁醇含量更高，这表明木葡萄球菌SX16对发酵香肠的风味属性有贡献。
图4 成熟后干发酵香肠中挥发性化合物的含量分布
Conclusion
本研究首次研究了从侗族发酵酸肉分离的蛋白水解微生物作为候选菌种在制造发酵香肠中的效果。使用包括木葡萄球菌SX16和植物乳杆菌CMRC6在内的多菌种发酵剂，加速了熟化过程中的酸化和蛋白水解，提高了发酵干香肠的微生物安全性和感官属性。
Effect of proteolytic starter culture isolated from Chinese Dong fermented pork (Nanx Wudl) on microbiological, biochemical and organoleptic attributes in dry fermented sausages
Xi Chen, Ruifang Mi, Biao Qi, Suyue Xiong, Jiapeng Li, Chao Qu, Xiaoling Qiao, Wenhua Chen, Shouwei Wang*
China Meat Research Center, Beijing 100068, China
Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, Beijing 100068, China
*Corresponding author.
cmrcwsw1@126.com
Abstract
The effect of a proteolytic starter culture isolated from Nanx Wudl, on microbiological, biochemical and organoleptic attributes of dry fermented sausages was investigated during processing. Based on preliminary screening, the combination of Staphylococcus xylosus SX16 and Lactobacillus plantarum CMRC6, showing excellent proteolytic activity in vitro, was selected as the multi-strain starter (starter LS). For comparison, the single-strain starter culture of L. plantarum CMRC6 (starter LB) and non-inoculated control were also tested. During fermentation, lactic acid bacteria and staphylococci dominated the microbiota and suppressed the Enterobacteriaceae growth in LS-inoculated sausages. The addition of LS starter accelerated acidification and proteolysis during ripening, improving the contents of total free amino acids and several essential free amino acids (Phe, Ile and Leu). Volatile compounds analysis revealed that LS-fermented sausage showed the highest abundance of 3-methyl-1-butanol, probably due to the inoculated S. xylosus. The inoculation of LS starter improved the sensory properties of sausages, especially the flavor attribute. Therefore, S. xylosus SX16 and L. plantarum CMRC6 are promising candidates for inclusion as multi-strain starters in the manufacture of gourmet fermented dry sausage.
该文章《Effect of proteolytic starter culture isolated from Chinese Dong fermented pork (Nanx Wudl) on microbiological, biochemical and organoleptic attributes in dry fermented sausages》发表于Food Science and Human Wellness 2021年10卷1期。点击下方阅读原文即可查看摘要原文。
编辑：袁月；责编：张睿梅