郫县豆瓣作为川菜发酵调味品，在发酵过程中起主要作用的微生物是曲霉属。由于传统生产工艺仍然比较粗放，在发酵过程监控不够严格和标准化的情况下，产品极易被黄曲霉污染而产生黄曲霉毒素。因此，AFB1污染情况已作为郫县豆瓣地理标志产品标准（把豆瓣地理标准列在这里）中的质量合格要求之一进行监测。研究建立一种准确、稳定、高效、快速、低成本的针对郫县豆瓣中AFB1的检测方法变得非常必要。
核酸适配体是由一般不超过100 个碱基组成的单链脱氧核糖核苷酸（ssDNA）或核糖核苷酸（RNA），能特异性结合靶标物质。近年来，适配体逐渐被应用到食品安全检测领域
西华大学食品与生物工程学院的黄玉坤、陶璇和陈祥贵*等人基于适配体识别作用构建郫县豆瓣中AFB1的HCR检测体系。该体系主要由AFB1适配体、互补链（cDNA）、氧化石墨烯（GO）、FAM标记的发夹1（HP1）和发夹2（HP2）组成。在此体系中，无AFB1存在时，HP1荧光被淬灭；AFB1存在时，HP1荧光恢复。在一定范围内，荧光强度与样品中AFB1的含量呈线性关系。最后将该方法用于多种郫县豆瓣样品中AFB1的测定，旨在为复杂基质的样品中AFB1的检测提供新的方法。
1 基于核酸适配体的HCR体系的传感策略设计原理
本实验基于核酸适配体的HCR体系检测AFB1的原理如图1所示。该传感器主要由AFB1适配体、cDNA、HP1和HP2组成。cDNA与AFB1适配体可通过氢键作用部分杂交配对，HP1和HP2与cDNA完全互补配对并可自身部分互补形成“发夹”结构的探针。HP1的5’末端（a链）修饰荧光分子FAM，3’端（b链）有6 个未配对的碱基作为黏性末端。cDNA通过与HP1的b链配对引发a与b解链。发夹结构HP1中被暴露出的a链与HP2中的a’链互补配对而引发HP2的b’与a’解链。HP2解链后的b’链会再次与HP1杂交，如此反复自组装，发生HCR，形成超长双链DNA，该双链DNA上有多个有机荧光素FAM。GO对单链DNA具有很强的吸附性能。HP1的黏性末端通过π-π堆积作用被吸附到GO表面，其末端的荧光基团FAM与GO发生荧光共振能量转移，荧光被淬灭。GO对双链DNA的吸附能力弱，因此发生HCR反应后的超长双链中FAM的荧光被淬灭的程度显著降低。当不存在靶标AFB1时，cDNA不能触发HCR的HP1与HP2结合，HP1关闭，荧光信号较低。当存在靶标AFB1时，适配体-AFB1的亲和力高于适配体-cDNA，cDNA触发HP1与HP2互补配对，HP1被打开并恢复荧光信号，从而实现对AFB1的定量分析。
2 序列设计
本实验中的HP1、HP2、cDNA通过NUPACK软件设计得到，通过Mfold软件模拟序列的二级结构如图2所示，HP1和HP2为发夹结构，cDNA为与AFB1部分互补的短链。该预测结果与实验设计的理想结构相符。
3 基于适配体的HCR检测体系的验
琼脂糖凝胶（质量分数2%）用于表征和验证HCR扩增和基于适配体的HCR系统。由图3可知，当不存在cDNA时，只有一条清晰的条带（泳道e），HP1和HP2未发生杂交，没有高分子质量DNA产物生成。加入不同浓度的cDNA时，泳道f～i有高分子质量的DNA生成，这表明cDNA的存在引发了HCR，并且随cDNA浓度的降低呈现平均分子质量增加的趋势。
由图4a可知，FAM在480 nm波长处受到激发后在波长516 nm左右具有最高的荧光强度。由图4b可知，GO在500～700 nm波长范围内都具有光吸收特性，与FAM标记发生荧光共振能量转移，进而引起荧光淬灭。
图5 进一步验证了基于适配体的HCR系统（AFB1适配体、cDNA、HP1、HP2、GO、AFB1的浓度分别为20 nmol/L、20 nmol/L、60 nmol/L、60 nmol/L、20 ng/mL、20 ng/mL）。未加入GO时，FAM的荧光不被淬灭，荧光强度较高（图5a）。加入GO后，HP1和HP2被吸附到GO表面，FAM荧光被淬灭，荧光强度明显降低（图5b）。加入cDNA时，cDNA引发了HP1和HP2之间的HCR，发夹探针的荧光得到恢复（图5c）。当靶标AFB1存在时，适配体与AFB1结合使得更多的cDNA引发HCR，生成多个聚合双螺旋DNA，荧光强度显著增强（图5d）。由此证明了该方法的可行性。
4 HCR实验条件优化
4.1 互补短链cDNA的浓度优化
cDNA作为HCR的引发链，其浓度对双链DNA产物的形成和荧光信号的强弱有着直接影响，本实验中固定适配体为40 nmol/L，优化了cDNA的浓度。如图6所示，随着cDNA的浓度增大，荧光强度显著升高。当cDNA与AFB1适配体浓度比达到1.25后，荧光强度缓慢升高，这表明cDNA引发HP1和HP2杂交产生的双链产物几乎达到了饱和状态。因此，选用浓度比为1.25时的cDNA浓度（50 nmol/L）为最佳反应浓度。
4.2 HP1和HP2浓度优化
在HCR体系中，HP1与HP2之间进行互补错位杂交，因此将HP1和HP2以1∶1的浓度比混合参与反应。如图7所示，荧光强度随着反应体系中HP1与HP2的浓度增大而增强。当HP1与HP2浓度达到60 nmol/L时反应体系的荧光强度最强，当HP1与HP2浓度继续增大，荧光强度降低。荧光强度降低可能是核酸浓度太高产生了空间位阻，导致杂交链的形成受到影响。因此选择60 nmol/L的浓度作为最佳反应浓度。
4.3 杂交孵育时间优化
由图8可知，荧光强度随着孵育时间的延长而增强。当孵育时间达到60 min后，荧光强度降低，说明孵育时间在60 min左右HCR已经几乎达到饱和状态，因此选择60 min作为最佳杂交孵育时间。
4.4 GO质量浓度优化
如图9所示，当GO质量浓度小于50 μg/mL时，荧光信号逐渐降低；当质量浓度超过50 μg/mL时，荧光信号基本不再变化。因此GO的最佳质量浓度为50 μg/mL。
5 荧光信号响应与校准曲线
在上述最佳的实验条件下研究了校准曲线和灵敏度。如图10a所示，随着一系列AFB1浓度的增加，荧光强度增加。图10b显示构建的基于AFB1适配体的HCR检测系统的荧光强度与AFB1质量浓度之间的线性关系。结果显示，AFB1在2～60 ng/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数R2=0.971，线性回归方程为Y=755.28X+49 448.17，检测限为1.84 ng/mL。
6 方法特异性实验
如图11所示，由于AFB1和AFB2分子结构具有较高相似性，该检测方法基于构象识别的原理表现为对AFB2存在18.92%的交叉反应率，与其他真菌毒素无显著交叉反应，表明方法的特异性强，可用于检测AFB1。
7 基于HCR的荧光检测法检测郫县豆瓣样品中的AFB1
通过向某个豆瓣样品中添加AFB1标准溶液，使最终加标质量浓度分别为4、1 5、3 0 n g/m L，采用本实验所建立的HCR法进行检测，每个样品做3 次平行实验。结果显示，本方法的加标回收率在8 5.7 3%～9 4.2 5%之间，相对标准偏差在3.24%～6.05%之间，表明该方法具有较好的准确度，可用于豆瓣样品中AFB1的检测。
对购买于本地超市的12 种不同品牌的郫县豆瓣样品进行实际样品的检测分析。10 个样品检测出AFB1，平均污染水平为3.42 μg/kg，最高污染水平为4.50 μg/kg，与GB 5009.22—2016酶联免疫吸附法相比，二者测定结果无显著差异（P＞0.05）。所有样品的检测均未超出国标限量（5 μg/kg），说明这12 种来自不同品牌的郫县豆瓣AFB1污染程度较小。
结 论
本研究建立了基于AFB1核酸适配体的HCR荧光检测方法。通过优化实验条件，最终确定cDNA浓度50 nmol/L；HP1和HP2浓度60 nmol/L；孵育时间60 min；GO质量浓度50 μg/mL。该方法的检测限为1.84 ng/mL，线性范围为2～60 ng/mL，R2=0.971。该方法在实际样品郫县豆瓣中的加标回收率为85.73%～94.25%。该方法用于12 种不同品牌的郫县豆瓣的检测，10 个样品检测出AFB1，平均污染水平为3.42 μg/kg，最高污染水平为4.50 μg/kg，与GB 5009.22—2016酶联免疫吸附法试剂盒检测结果无显著差异。本研究建立的检测方法操作简单，选择性强，无需标记AFB1核酸适配体，不影响核酸适配体的结构变化，不干扰其与AFB1的结合。同时，采用HCR体系扩大信号，提高了检测方法的灵敏度，为复杂基质样品中AFB1的检测提供了新的检测方法。
本文《基于适配体杂交链式反应检测郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1》来源于《食品科学》2020年41卷22期301-307页，作者：黄玉坤，陶璇，邵坤，王冲，王力均，车振明，陈祥贵。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190903-037。
近期研究热点
修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅
图片来源于摄图网及文章原文