空肠弯曲菌是革兰氏阴性微需氧菌，主要存在于家禽和野禽体内，是一种人畜共患的细菌病原体，会引发腹泻、流产、不育、乳房炎以及传染性肝炎等疾病。世界卫生组织已将空肠弯曲菌定义为常见的食源性致病菌之一。微酸性电解水（SAEW）是在无隔膜电解槽中电解稀盐或稀盐酸溶液而生成的具有特殊理化性质的水溶液，因具有杀菌高效广谱、腐蚀性低、安全环保、pH值更加温和等优点，已在食品行业中广泛应用。
西北农林科技大学食品科学与工程学院的宋欣坤、庞柳欣、张春玲*等以空肠弯曲菌作为研究对象，考察SAEW对纯培养空肠弯曲菌的杀灭效果，以及有机质对杀菌效果的影响，同时对SAEW杀灭多代空肠弯曲菌的效果进行评估，以确保SAEW杀菌方式的安全性；最后，对SAEW杀灭空肠弯曲菌的特性和机制进行研究，以期为SAEW对食品中空肠弯曲菌的杀灭提供理论依据。
1 不同ACC的SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
采用不同ACC的SAEW和NaClO溶液对空肠弯曲菌进行2 min杀灭处理。由图1可以看出，随着ACC的增加，SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果逐渐增强，呈浓度依赖性。相同ACC时，SAEW处理后空肠弯曲菌的减少量显著大于NaClO处理（P＜0.05），表明SAEW杀灭作用更强。有研究表明，ACC为20 mg/L的SAEW处理1 h或2 h后，空肠弯曲菌减少1.5～1.7（lg（CFU/g）），抑制作用显著大于相同ACC的酸性电解水处理组。
2 SAEW处理不同时间对空肠弯曲菌的杀灭效果
采用ACC为30 mg/L的SAEW对空肠弯曲菌分别进行1、2、5 min和10 min的处理，结果如图2所示。随着处理时间的延长，SAEW和NaClO对空肠弯曲菌的杀灭效果均逐渐增强，并且不同处理间具有显著性差异（P＜0.05）。研究表明，ACC为60 mg/L的SAEW处理10 min后可以完全杀灭肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌，并且SAEW对蜡样芽孢杆菌的灭活效果在很大程度上取决于ACC水平和暴露时间以及菌株和生长条件。在SAEW和NaClO处理1 min内空肠弯曲菌减少速度最快，分别减少了5.42（lg（CFU/mL））和4.72（lg（CFU/mL）），当处理时间为10 min时，SAEW处理和NaClO处理的空肠弯曲菌减少量均达到最大，分别为6.23（lg（CFU/mL））和5.22（lg（CFU/mL））。结果表明，相同处理时间条件下SAEW比NaClO的杀菌效果更好。
3 蛋白质对SAEW杀灭空肠弯曲菌的影响
3.1
不同蛋白质量浓度SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
在不同质量浓度BSA干扰下，采用ACC为30 mg/L的SAEW处理空肠弯曲菌2 min，结果如图3所示。随着蛋白质量浓度增加，SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果逐渐减弱，BSA为0 g/L时，SAEW处理组空肠弯曲菌减少量为5.72（lg（CFU/mL）），BSA为30 g/L时，SAEW处理组为3.41（lg（CFU/mL）），与BSA质量浓度为0 g/L时相比下降了40.38%，不同蛋白质量浓度对SAEW杀菌效果的影响有显著差异（P＜0.05）。相同蛋白质量浓度下，NaClO处理组杀灭效果弱于SAEW处理组。有研究发现SAEW杀菌效果会随着蛋白质浓度的增加而减弱。Ni等研究也发现，SAEW处理大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率随着ACC的增加而增加，随着BSA质量浓度的增加而降低，并且增加蛋白质浓度可以加速SAEW的ACC的降低。以上研究表明，蛋白质会显著影响SAEW和NaClO的杀灭效果，蛋白质量浓度越高，SAEW的杀菌效果越差，因此在SAEW的实际应用中应降低接触蛋白质的浓度，保证SAEW的杀灭效果。
3.2
蛋白质存在时不同ACC的SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
在10 g/L蛋白质存在时，采用ACC分别为10、20、30、40 mg/L和50 mg/L的SAEW和NaClO溶液处理菌液2 min，结果如图4所示。随着ACC的增加，SAEW对菌液的杀灭效果逐渐增加，当ACC小于20 mg/L时，SAEW处理组和NaClO处理组的杀菌效果无显著差异（P＞0.05），推测蛋白质在一定程度上干扰了ACC较低时SAEW中游离氯的作用，当ACC大于20 mg/L时，即使存在蛋白质干扰，SAEW的杀菌效果也强于NaClO，表明当ACC小于20 mg/L时，蛋白质消耗了大部分有效氯，导致杀菌效果大大减弱。在电解水应用于肉类工业的研究中发现，有机物存在时，与NaClO的杀菌效果相比，SAEW的杀菌效果更稳定。因此在处理肉类等含有蛋白质的样品时，应选取合适ACC的SAEW处理样品。
3.3
蛋白质存在时SAEW处理不同时间对空肠弯曲菌的杀灭效果
在10 g/L蛋白质干扰下，采用ACC为30 mg/L的SAEW处理空肠弯曲菌1、2、5 min和10 min，结果如图5所示。随着处理时间的延长，SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果增强，当SAEW处理10 min时，空肠弯曲菌减少数量达到最大值（4.12（lg（CFU/mL））），低于相同ACC的SAEW处理空肠弯曲菌纯培养液时的最大值（6.23（lg（CFU/mL）））。SAEW和NaClO处理1 min内空肠弯曲菌减少速率最快，1 min后趋于稳定。有研究发现，在模拟洗涤的过程中，与蔬菜产品相比，肉类消耗有效氯更快。Park等的研究也发现，随着蛋白质的增加，游离的有效氯含量降低。SAEW杀菌效率的不断降低是有机质不断消耗有效氯导致的。虽然蛋白质会减弱杀菌作用，但是SAEW杀菌效果仍然强于NaClO，因此在食品工业中应用SAEW时应考虑不同食品中蛋白质的数量和类型，合理选择处理时间，从而优化杀菌条件和效果。
4 SAEW多代杀菌效果
采用ACC为10 mg/L的SAEW对多代培养的空肠弯曲菌处理2 min，考察SAEW的杀灭效果，结果如图6所示。SAEW对第一代菌的杀菌率为26.3%，之后每代的杀菌率均在24.95%～29.80%，且差异较小。梁铎通过连续多代处理，分析SAEW对单增李斯特菌的多代杀菌效果，第一代杀菌率为56.33%，之后每代的杀菌效果均在47.71%～82.75%之间，且差异不显著（P＞0.05），这表明单增李斯特菌在10 代之内对SAEW不产生耐药性。由实验结果可知，10 代以内空肠弯曲菌不会对低浓度SAEW产生耐受性而降低杀菌效果，因此，可以采用SAEW杀灭空肠弯曲菌。
5 SAEW处理对空肠弯曲菌细胞活力的影响
通过荧光显微镜观察SAEW和NaClO处理对空肠弯曲菌细胞活力的影响，结果如图7所示。SYTO9是一种可渗透细胞的核酸染料，PI仅穿透膜受损的细菌，具有完整细胞膜的细菌被染成绿色荧光，膜受损的细菌显示红色荧光。由图7A可知，无菌去离子水处理的空肠弯曲菌多数为强绿色荧光，红色荧光数较少，表明对照组细胞膜几乎完好无损。随着ACC的增加，红色荧光数大幅增加，表明SAEW、NaClO对细胞膜完整性的破坏与浓度呈正相关，且相同ACC条件下NaClO处理组（图7b～f）的红色荧光明显少于SAEW处理组（图7B～F），表明SAEW对细胞膜的损伤程度更强。有研究使用SAEW处理腐败链球菌和腐生链球菌，也发现SAEW会破坏细胞膜完整性。用ImageJ软件对荧光图片进行定量分析，结果如图8所示。随着ACC的增加，红色荧光与绿色荧光比值逐渐增加，表明细胞膜破坏程度加深，与荧光图片结果一致。当ACC大于等于40 mg/L时，SAEW处理和NaClO处理的红色荧光与绿色荧光的比值存在显著性差异（P＜0.05），表明此时SAEW对细胞膜的破坏作用明显强于NaClO处理。以上研究表明，SAEW可能通过损害细胞膜完整性杀灭空肠弯曲菌。
6 SAEW处理对空肠弯曲菌形态的影响
对不同ACC的SAEW处理了2 min的空肠弯曲菌形态通过扫描电子显微镜进行观察，以无菌去离子水作为对照，结果如图9所示。无菌去离子水处理的菌体图像呈现较完整和光滑的弯曲形（图9A），而SAEW处理的菌体表面能清楚地观察到不规则、褶皱、凹陷、破损甚至破裂（图9B～F），且菌体表面损伤程度随着ACC的增加而增加。类似研究发现，SAEW会破坏和损伤大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，使其形态发生改变，推测SAEW可能通过改变菌体形态、增强膜的渗透性和细菌悬浮液中的导电性，导致钾离子和蛋白质从细菌细胞中释放出来。以上研究表明，SAEW处理会改变菌体形态，导致其表面呈现不同程度的损伤，因此可以推测SAEW可能通过改变和破坏菌体形态结构杀灭空肠弯曲菌。
7 SAEW处理对空肠弯曲菌细胞膜损伤的影响
7.1
SAEW处理后空肠弯曲菌细胞内DNA的泄漏情况
采用不同ACC和处理时间，观察SAEW对细胞内核酸泄漏的影响，结果如图10所示。处理组的OD260nm远高于对照组，且OD260nm与ACC呈正相关。然而，随着处理时间的延长，OD260nm先迅速上升后趋于平稳。相似的研究表明，Rhizopus stolonifer OD260nm随着超声功率和SAEW ACC的增加而增加，当联合使用500 W的超声和55 ℃ 50 mg/L的SAEW处理10 min时，OD260nm最高，表明此时胞内物质泄漏最严重，细胞膜被破坏，导致胞内成分释放。有研究表明SAEW处理腐生链球菌时，腐生链球菌的细胞外DNA含量显著增加（P＜0.05），且与SAEW的ACC呈正比。以上结果表明，SAEW处理会导致空肠弯曲菌中核酸泄漏，与ACC呈浓度依赖性，因此可以推测SAEW通过增加细胞膜的通透性，导致细胞内核酸泄漏，从而杀灭空肠弯曲菌。
7.2
SAEW处理后空肠弯曲菌细胞内蛋白质的泄漏情况
蛋白质量浓度可以反映细胞膜的完整性，已测定的标准曲线表明OD 570nm 与蛋白质量浓度有良好的线性关系（y＝0.5772x+0.6308，R 2 ＝0.9962），根据标准曲线得到的样品中蛋白质量浓度的结果如图11所示。与对照组相比，蛋白质泄漏质量浓度随着ACC的增加而增加，呈浓度依赖性，且ACC大于等于30 mg/L时，蛋白质泄漏质量浓度显著增加（P＜0.05）。有研究表明酸性电解水可以通过增加细胞膜的渗透性导致细胞内成分的泄漏，从而抑制细菌生长，与本研究结果一致。Osafune等报道细胞质结构会被酸性电解水冲洗出细胞壁。因此，可以推测SAEW通过增加细胞膜的通透性，导致细胞质成分泄漏，从而杀灭空肠弯曲菌。
7.3
SAEW处理对空肠弯曲菌细胞内ATP浓度的影响
ATP在细胞的各种生理、病理中起着重要作用，ATP水平的变化会影响细胞的功能。已测定的标准曲线表明荧光强度与ATP浓度呈良好的线性关系（y＝35 578x+3621.3，R2＝0.9998），根据标准曲线得到的样品中ATP浓度的结果如图12所示。与无菌去离子水对照组相比，细胞ATP浓度随着ACC的增加而降低，呈浓度依赖性，且ACC大于等于30 mg/L时，ATP浓度极显著降低（P＜0.01）。对照组ATP浓度为（0.30±0.01）μmol/L，当ACC为50 mg/L时，处理后的ATP浓度仅为（0.06±0.02）μmol/L。类似研究发现，3-苯丙酸和SAEW联合处理会造成Klebsiella oxytoca的ATP水平显著变化，表明其联合处理破坏了细胞膜的完整性，导致ATP泄漏，且细胞损伤随着暴露时间的延长而增加。以上研究表明，SAEW会破坏细菌细胞膜的完整性并渗透到细胞中，导致ATP浓度下降。
结 论
本研究表明，SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果与处理时间和ACC呈正相关，并且SAEW的杀灭效果显著高于相同ACC的NaClO，蛋白质存在时，SAEW的杀菌效果会随着蛋白质量浓度的增加而减弱，将空肠弯曲菌进行连续多代处理，在10 代内并未对低浓度SAEW产生明显的抗药性反应。SAEW处理破坏了空肠弯曲菌的形态和细胞膜的完整性，且破坏程度呈浓度依赖性。SAEW处理会导致空肠弯曲菌细胞内核酸、蛋白质、ATP泄漏，细胞活性下降等变化，推测SAEW通过破坏膜完整性杀灭空肠曲菌。
本文《微酸性电解水对空肠弯曲菌的杀灭特性及机制》来源于《食品科学》2024年45卷第08期29-36，作者：宋欣坤，庞柳欣，牛玲玲，岳 婷，牛际涵，张春玲*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20230619-147。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网