王定南出生于1910年，河南省南阳市内乡县人。青少年时期，王定南广泛阅读进步书籍，关心国家前途与命运，并积极探索救国救民的道路，逐渐成长为一名忧国忧民的进步青年，革命思想也在他心中萌芽。
1929年4月，王定南参加了共青团，同年，他在北京大学读书时，担任了北大团支部书记等职务。在校期间，王定南积极宣传我党的革命思想，引导同学们走向进步与光明。同时，他还参加了北平的反帝大同盟，与同学们参加了各种反帝反封建爱国斗争，积累了一定的革命经验。
1930年，王定南转为正式党员。在这之后，他主要活跃在北方，在培养革命骨干分子以及积蓄革命武装力量方面做了大量卓有成效的工作。1931年，九一八事变后，王定南积极宣传我党的抗日主张，向群众宣讲抗日救亡的道理，与国民党的不抵抗政策进行了坚决的斗争。
1935年年初，河南省委遭到敌人破坏，北方局便把王定南调到许昌。到许昌之后，王定南致力于恢复河南省委，他不顾个人危险，深入基层，在基层组织重建与营救被关押同志方面做了大量的工作，促进了河南省委的恢复。河南省委恢复之后，王定南担任了河南省委书记，全面领导河南省的革命斗争活动。
1937年，王定南被调到北平特委，主要负责孙殿英的统战工作，次年，他担任了北平特委书记。当时的北平非常危险，不仅有日伪军，也有国民党特务，那段时期，王定南坚持我党既独立自主，又联合抗日的统一战线政策，与敌人进行了有理、有力与有节的斗争，尤其是在社会上层人士和国际人士的统战工作方面取得了显著的成效，受到了毛主席的表扬。
值得一提的是，王定南在情报收集方面也作出了重要的贡献，为晋察冀根据地领导反“扫荡”、反封锁与反“蚕食”斗争提供了重要的行动参考资料。期间，王定南多次被捕，受尽了敌人的酷刑，但他始终保持着一个党员的铮铮铁骨，没有暴露组织的任何秘密。
为了防止王定南继续收集情报，日本侵略者甚至专门安排了一个宪兵队，与王定南住在一起，监视王定南。当时孙殿英已经投靠了日本人，王定南过去与孙殿英有过联系，于是他就请孙殿英帮忙。孙殿英也想给自己留条后路，于是就帮助王定南。在孙殿英的帮助下，日本宪兵对他的看管有所松懈，此后王定南趁机跟着孙殿英的部队离开北平，前往豫西一带。
1945年5月，王定南在与组织失去联系的情况下，主动深入国民党高树勋部，并促成了高树勋部与我党建立稳定的友好关系，后续高树勋率部加入我军，对国民党反动派造成了极大的震撼，解放战争胜利的天平也开始向我军倾斜。
新中国成立后，王定南担任了内务部专员、秘书等职务，“大跃进”时期，他因实事求是地反映农村的问题受到批判，并被认定为“右倾”。虽然受到不公平对待，但王定南始终相信组织会调查清楚自己的问题。
1961年，王定南调任山西省文史研究馆副馆长，1966年，十年浩劫开始后，他继续受到冲击，并被关押审查长达七年之久。1977年，王定南恢复工作，此后他担任了山西省政协副主席等职务，于1990年因病去世，享年80岁。