撰文 | 木兰之枻
责编 | 兮
所有正常的免疫系统都具有区分“自我”和“非我”的能力：免疫系统可以通过自我调节，在有效杀伤外源病原体的同时避免自身免疫病的发生【1】。作为原核生物的适应性免疫系统，CRISPR-Cas系统同样具有自我调节能力。已有研究指出，面对噬菌体感染、膜应激和代谢压力等内外源刺激，CRISPR-Cas系统的表达水平会发生明显改变【2】，但具体的调控机制并不明了。
近日，来自美国约翰霍普金斯大学医学院的Joshua W. Modell实验室在Cell发表题为A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression的论文。文章对细菌中CRISPR-Cas系统表达的自我调控机制进行了研究，发现细菌中天然存在一种单链向导RNA tracr-L，它能募集Cas9抑制其自身启动子的转录，从而实现CRISPR-Cas系统表达的自我调节。该自我调控机制在II-A型CRISPR-Cas系统中广泛存在：如果解除抑制，CRISPR-Cas系统介导的免疫活性会上调3000倍，但也会引发严重的自体免疫毒性。
为探寻CRISPR-Cas系统的调控因子，研究者选用表达酿脓链球菌（S. pyogenes） II-A型CRISPR-Cas9系统的金黄色葡萄球菌（S. aureus）的杂合体系，通过转座子突变测序（Tn-seq）技术开展遗传筛选。结果显示，CRISPR基因座内部位于tracr-L启动子和5’末端的区域对CRISPR-Cas系统的免疫功能至关重要：该区域被破坏后，相关的免疫功能明显增强。已知该区域表达一种名为tracr-L的非编码RNA，研究者对tracr-L在CRISPR-Cas系统免疫功能调控中的角色进行分析，发现tracr-L能破坏CRISPR-Cas系统间隔序列的获取并抑制各组分的表达，最终抑制其免疫功能。
进一步的研究指出， tracr-L能直接结合Cas9蛋白抑制Cas9基因内源性启动子Pcas的活性，这源自tracr-L 5’端对Pcas转录起始位点附近序列的识别和结合（识别序列长度为11bp且PAM位点为NGG，可保证tracr-L-Cas9复合物可结合在该区域但不会发生切割）。研究者还指出，tracr-L本身便会形成类似于单链向导RNA的结构以发挥功能，其对Pcas启动子的抑制机制类似于sgRNA-dCas9复合物对基因转录的抑制 （图1）。
已知II-A型CRISPR-Cas系统的免疫功能依赖于Cas9蛋白和两种非编码RNA，即tracrRNA和crRNA，其中tracrRNA分tracr-S和tracr-L两种。正常条件下，tracr-S结合并介导crRNA前体（pre-crRNA）的加工成熟，进而结合Cas9蛋白发挥功能。之前研究者对tracr-L与crRNA的关系缺乏了解。本研究指出，pre-crRNA并不结合tracr-L，但成熟后的crRNA能结合并干扰tracr-L对Pcas启动子的抑制。此外，crRNA-tracr-S可与tracr-L竞争性结合Cas9蛋白，进一步降低其对Pcas启动子活性的抑制。因此，tracr-L对Pcas启动子活性的抑制还存在crRNA介导的反馈调控机制，从而让调控机制更加完善。
研究者还发现，tracr-L对Pcas启动子活性的抑制能够在保证识别杀伤外源病毒入侵的同时避免自体免疫毒性的出现。此外，系统分析指出，34/80种II-A型CRISPR-Cas系统中均有tracr-L的存在，其功能很可能是参与对Cas基因转录的调控，这表明tracr-L对Pcas启动子活性的调控在II-A型CRISPR-Cas系统中具有普遍性。
图1 tracr-L对Pcas启动子活性的调控机制
总体而言，本研究以酿脓链球菌（S. pyogenes）的II-A型CRISPR-Cas9系统为研究对象，发现了一种天然的单链向导RNA tracr-L，可以直接结合Cas9蛋白并抑制其自身启动子的转录，从而调控CRISPR-Cas9系统的免疫功能。这一内在的自我调控机制在II-A型CRISPR-Cas系统中普遍存在，这有助于CRISPR-Cas系统在识别杀伤外源病毒入侵的同时避免自体免疫毒性的出现。此外，这一结果对于Cas9工具的开发也有重要的指导意义：在保证Cas9工具功能的同时尽可能减少其毒副作用将有助于工具的临床转化应用。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.017
制版人：Kira
参考文献
1. Gasteiger, G., and Rudensky, A.Y. (2014).Interactions between innate and adaptive lymphocytes. Nat. Rev. Immunol. 14,631–639.
2. Patterson, A.G., Yevstigneyeva, M.S., and Fineran, P.C. (2017). Regulation ofCRISPR-Cas adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 37, 1–7.