一张棕黄色的组织切片，可以帮助判断：
蛋白主要表达在哪类细胞中；
位于细胞核、细胞质还是细胞膜；
肿瘤组织与正常组织之间是否存在差异；
蛋白表达是否与分期、预后或治疗反应相关；
药物或基因干预后，组织表型是否发生改变。
本篇将从实验原理出发，介绍免疫组化的基本流程、关键要点、结果判读方法及其在科研课题中的应用。
图 1：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/710723585
什么是免疫组化？
免疫组化（immunohistochemistry），简称 IHC。其基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合，在组织切片中识别目标蛋白，再通过酶促显色反应将抗原所在位置显示出来。
常规免疫组化的基本过程可以概括为：目标蛋白作为抗原→ 一抗特异性识别目标蛋白→ 酶标二抗或检测系统识别一抗→ 显色底物发生颜色反应→ 显微镜观察蛋白表达和组织定位。
临床和科研中最常见的是 HRP–DAB 显色系统。HRP 为辣根过氧化物酶；DAB 为显色底物；反应后形成棕黄色沉淀；苏木精通常将细胞核复染为蓝色。因此，在常见免疫组化切片中：棕黄色代表目标蛋白阳性信号；蓝色代表经苏木精复染的细胞核。
图 2：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/710723585
免疫组化与免疫荧光有什么区别？
免疫组化和免疫荧光都依赖抗原—抗体反应，但显示信号的方式不同。免疫组化适合观察组织结构和蛋白表达，免疫荧光更适合观察多指标共定位和空间关系。
免疫组化常用在哪些样本中？
常见样本包括：石蜡组织切片；冰冻组织切片；组织芯片；动物组织；人体肿瘤及癌旁组织；类器官和细胞蜡块。其中，福尔马林固定、石蜡包埋组织是最常用的样本类型。
石蜡切片具有组织结构清晰、便于长期保存和适合回顾性研究等优点，但福尔马林固定会使蛋白发生交联，遮蔽部分抗原表位，因此通常需要进行抗原修复。
实验开始前需要明确什么？
1、明确目标蛋白的理论定位
实验前应查清目标蛋白主要位于：细胞核；细胞质；细胞膜；细胞外基质；某类特殊细胞或组织区域。
例如：Ki-67 主要表现为细胞核染色；
E-cadherin 常见于细胞膜；
Vimentin 主要位于细胞质；
Collagen I 主要分布于细胞外基质；
CD3、CD8 常用于识别特定 T 细胞群体。
如果实验结果与理论定位明显不符，应优先排查抗体特异性和实验条件。
图 3：https：//health.baidu.com/m/detail/ar_5570524179579420287
2、确认抗体是否适用于免疫组化
同一抗体可能适用于 Western blot，却不一定适用于免疫组化。购买或使用抗体前，应确认：
是否标注适用于 IHC-P 或 IHC-F；
适用物种是人、小鼠还是大鼠；
推荐的抗原修复方法；
推荐稀释比例；
已验证的阳性组织；
理论分子定位；
是否有公开文献或染色图片支持。
其中：IHC-P 通常指石蜡切片免疫组化；IHC-F 通常指冰冻切片免疫荧光。
免疫组化结果应该怎么看？
1、阳性信号位于哪里？
首先判断棕黄色信号位于：细胞核；细胞质；细胞膜；细胞外基质；血管；肿瘤间质；某类特殊细胞。定位是判断结果是否合理的第一步。
如果一个典型膜蛋白主要出现弥漫性核染色，就应考虑非特异性染色或抗体质量问题。
2、哪些细胞表达目标蛋白？
肿瘤组织中不仅有肿瘤细胞，还包括：T 细胞；巨噬细胞；中性粒细胞；成纤维细胞；血管内皮细胞；淋巴内皮细胞；平滑肌细胞。
免疫组化看到某个蛋白升高，并不能自动说明它来自肿瘤细胞。必要时应结合：连续切片染色；双重或多重免疫组化；多重免疫荧光；原位杂交；单细胞或空间组学数据。
3、阳性细胞有多少？
可以统计：阳性细胞比例；单位面积阳性细胞数；肿瘤核心与浸润边缘的细胞密度；间质区与肿瘤区的阳性细胞数量。
对于免疫细胞标志物，单位面积阳性细胞密度通常比单纯比较染色深浅更合适。
4、阳性信号有多强？
常见强度分级可以设置为：
- 0 分：无明显染色；
- 1 分：弱阳性；
- 2 分：中等阳性；
- 3 分：强阳性。
但人工判断具有一定主观性，因此应尽量由两名不知道临床分组信息的观察者独立评分，或使用数字病理软件进行定量。
免疫组化如何定量？
免疫组化不能只展示「代表性图片」，还应进行客观定量。
1、阳性细胞比例
计算公式为：阳性细胞比例=阳性细胞数/总细胞数 X 100%
适用于 Ki-67、p53、ER、PR 及部分免疫细胞标志物。
图 4：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/83654843？s_r=0
2、阳性面积比例
计算目标棕黄色区域占总组织区域或感兴趣区域的比例。
适用于：细胞外基质蛋白；胶原相关指标；弥漫性胞质蛋白；血管或特定组织结构。需要注意，阳性面积增加可能来自表达增强，也可能来自阳性细胞数量增加。
图 5：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/603810712
3、平均光密度和积分光密度
常见指标包括：平均光密度；积分光密度；单位面积积分光密度。
使用图像软件分析时，应统一：白平衡；光源和曝光参数；放大倍数；感兴趣区域；色彩分离方法；阳性阈值；背景扣除方式。如果不同图片的拍摄条件不同，光密度通常不适合直接比较。
图 6：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/613052671
4、H-score 评分
H-score 同时考虑不同强度的阳性细胞比例：将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。
图 7：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/693130546
免疫组化在科研课题中的应用
应用一：验证组学筛选出的候选蛋白
转录组、蛋白组或单细胞分析发现候选基因后，可以通过免疫组化验证其蛋白表达和组织定位。
基本逻辑为：公共数据发现候选基因异常→ 免疫组化验证肿瘤组织中的蛋白水平→ 分析其与分期、分级和预后的关系。
但 mRNA 升高并不一定意味着蛋白表达同步升高，因此组织蛋白验证非常重要。
应用二：明确候选蛋白的细胞来源
肿瘤组织中的蛋白可能来自肿瘤细胞，也可能来自免疫细胞、成纤维细胞或血管内皮细胞。
可以通过：组织形态判断；连续切片染色；多重免疫组化；多重免疫荧光；单细胞数据辅助定位。免疫组化能够提供初步的组织学定位，但当细胞来源复杂时，通常需要多指标联合验证。
应用三：评价细胞增殖、凋亡和损伤
常见指标包括：Ki-67：细胞增殖；cleaved caspase-3：凋亡；γH2AX：DNA 损伤；p21：细胞周期停滞或衰老相关状态；LC3 和 p62：自噬相关变化。
这些指标可用于评价基因干预或药物治疗后的组织效应。
应用四：评价肿瘤免疫微环境
应用五：评价肿瘤间质和血管
常见指标包括：
• α-SMA：活化成纤维细胞及平滑肌相关标志；
• FAP：活化成纤维细胞相关标志；
• Collagen I：胶原沉积；
• Fibronectin：细胞外基质；
•CD31：血管内皮；
•LYVE1、PDPN、PROX1：淋巴内皮相关指标。
这些指标可用于研究肿瘤纤维化、血管生成、淋巴管生成和免疫排斥。
应用六：分析临床预后和治疗反应
将免疫组化评分与临床资料结合，可以分析目标蛋白与以下指标的关系：
肿瘤分期；病理分级；淋巴结转移；复发；总生存期；无进展生存期；药物治疗应答。
免疫组化的作用是把分子表达、组织结构和临床表型连接起来。
只有规范实验流程、统一图像采集和定量标准，并结合功能实验建立因果关系，免疫组化结果才能从一张代表性图片，真正转化为支撑科研结论的可靠证据。
编辑：小 z
题图：自制