在生物学研究的广阔领域中，蛋白质表达作为多种生物系统的核心环节，其重要性不言而喻。而重组表达技术更是支撑生物学研究不断深入发展的关键基石。自上世纪70年代以来，大肠杆菌（E.coli）凭借其传代迅速、培养简易以及丰富的研究工具储备，成为了重组蛋白表达领域应用最为广泛的宿主之一。
然而，如同光明背后总有阴影，大肠杆菌在异源蛋白表达过程中，存在着表达量低甚至无法表达的棘手问题。
近期，清华大学化学工程系于慧敏教授团队在 Biotechnology Advances 期刊发表了题目为：Strategies to overcome the challenges of low or no expression of heterologous proteins in Escherichia coli 的综述论文，针对大肠杆菌异源蛋白表达所面临的挑战，提出了一系列具有创新性和可行性的解决方案。
重组蛋白 在大肠杆菌中的表达涉及多个复杂步骤，包括宿主选择、基因克隆、载体构建、表达条件优化和表达结果验证。影响蛋白表达效率的因素主要有蛋白毒性、基因序列的内在影响和 mRNA 结构等。对症下药，作者对这些关键因素逐一深入剖析，提出针对性的解决策略。
蛋白毒性是 E.coli 表达系统常遇到的挑战之一。这些蛋白质会破坏宿主的正常生理过程，进而抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，诸如核糖核酸酶、人雌激素受体 α、DNA 结合蛋白等毒性蛋白。应对毒性蛋白表达的策略主要包括工程改造菌株、设计新的宿主菌株或将蛋白分泌到细胞外，以避免破坏细胞内生长。
开发新的宿主菌株来耐受毒性蛋白是一种可行的方法，通常将信号肽融和到目标蛋白的 N 端，有效促进目标蛋白的分泌表达。大肠杆菌Ⅱ型分泌途径被广泛用于将目标蛋白精准分泌到细胞外，实现蛋白的高效表达，包括 Sec 依赖性通路、信号识别颗粒（SRP）通路和双精氨酸易位（TAT）通路。
大肠杆菌的Ⅱ型分泌途径
基因序列的差异可能会导致重组蛋白不表达，具体表现在mRNA与核糖体结合、翻译起始和肽链延伸。密码子偏好是影响蛋白质表达的关键。为了克服密码子使用和mRNA结构相关的表达难题，需要优化基因序列。
早期研究主要对密码子频率和适应指数（CAI）进行优化，随着研究的深入开始考虑优化更全面的参数，例如 tRNA 适应指数（tAI）和归一翻译效率（nTE）等。同时还出现一系列实用工具用于基因序列的优化。
融合标签技术提高了大肠杆菌可溶性蛋白表达，在调节翻译起始区附近的核苷酸序列和整合外源功能标签方面展现出独特的优势。常用的融合标签有 MBP、SUMO、TrxA 等，以及多肽标签（例如MSKIK），有效防止或缓解核糖体停滞。
本文还对基于大规模数据和深度学习的综合优化方法进行概述。目前用来预测和提高蛋白表达水平的综合优化方法有 6AA/31C、MPEPE、SoluProt、ICOR、COSMO、BiLSTM-CRF、DeepTESR 等。
大肠杆菌蛋白表达优化和增强策略的发展与未来蓝图
重组蛋白表达技术相对来说发比较成熟。如今，科研人员在大肠杆菌原核表达系统的基础之上，开发出酵母、昆虫、哺乳动物等真核细胞表达系统。通过不同的表达系统，为现代蛋白质生物化学研究奠定了坚实的基础。
每种表达系统并非完美无缺，它们有着各自的优势与局限。选择合适的表达系统需要综合考虑目标蛋白的研究背景、理化特性、生物学功能和下游应用等因素，进行全面而深入的分析和权衡。
在此，特邀义翘神州重组蛋白研发经理于璐璐博士，将在1月9日（周四）19:00 为大家在线分享：重组蛋白表达系统的选择策略——全面解析及案例分享。
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参考文献：
Ruizhao Jiang, et al. Strategies to overcome the challenges of low or no expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Biotechnology Advances, 2024.