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动物行为学实验是神经科学研究领域的重要组成部分，主要侧重于科学客观地评价各种条件下的动物行为。动物行为学实验种类繁多，研究不同的疾病模型时，研究人员需根据关注的具体行为选择合适的研究手段。《动物行为实验手册》为学习记忆类、抗焦虑抑郁类、抗疲劳类、神经精神类、痛觉测试类、嗅觉测试类、社会行为类及特定行为评估类等，其中许多实验需要借助特制的仪器、记录及分析系统。
树突状细胞（DCs）负责维持肠道对无害抗原的耐受性；然而，细菌代谢产物诱导DC耐受性的机制仍有待研究。
基于此，2024年12月28日天津医科大学基础医学院免疫学系王荃研究团队在Cell Reports杂志发表了“Gut bacterial L-lysine alters metabolism and histone methylation to drive dendritic cell tolerance”揭示了肠道细菌产生的L-赖氨酸通过改变树突状细胞的代谢途径和组蛋白甲基化，促使DCs进入耐受状态。这一过程有助于在炎症性疾病中恢复免疫系统的稳态。。
在此，作者观察到肠道共生细菌衍生的L-赖氨酸通过树突状细胞中的单磷酸腺苷（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）/乙酰辅酶A（AcCoA）-雷帕霉素（mTOR）轴，刺激丝氨酸、甘氨酸、一碳代谢（SGOC）。这种激活导致S-腺苷甲硫氨酸（SAM）增加，以及端粒沉默破坏因子1样蛋白（DOT1L）表达上调，从而使得转化生长因子β（Tgfb）以及信号转导及转录激活因子3（Stat3）基因启动子处的组蛋白H3赖氨酸79位点二甲基化（H3K79me2）富集增强，促使树突状细胞呈现免疫耐受特性。利用免疫炎症疾病小鼠模型和磷酸甘油酸脱氢酶（Phgdh）条件性敲除小鼠，证实了赖氨酸诱导的树突状细胞耐受性可恢复体内稳态。单细胞RNA测序分析显示，L-赖氨酸在体内通过将树突状细胞转变为耐受状态，在炎症紊乱期间恢复体内稳态。此外，还鉴定出了细菌有效产生L-赖氨酸的相关酶。该研究揭示了一种通过细菌L-赖氨酸、SGOC代谢、组蛋白甲基化和树突状细胞耐受性之间复杂相互作用来调节免疫稳态的未知机制。
图一 各种二肽和氨基酸对骨髓来源树突状细胞的影响
作者分别采用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）对路德维希肠杆菌（E. ludwigii，该细菌是革兰氏阴性，发酵性，能动杆，具有肠杆菌属和阴沟肠杆菌复合体的一般特征）、K12菌株以及脑心浸液肉汤（BHI）的总培养基上清液和小于3千道尔顿（kDa）的上清液组分中的代谢产物进行了分析。KEGG 代谢通路富集分析表明E. ludwigii组赖氨酸相关代谢通路上调，其上清液中一系列含赖氨酸的二肽和赖氨酸显著升高。用含赖氨酸的二肽处理骨髓来源的DCs（BMDCs），发现苯丙氨酰赖氨酸（FK）以剂量依赖方式对上调耐受性相关基因Aldh1a2和Pdl1效果最佳。进一步实验表明，在 FK 中的成分里，仅赖氨酸能增加耐受性基因表达。检测E. ludwigii上清液中上调的二肽所含氨基酸，仅赖氨酸以剂量依赖方式促进 BMDCs中Tgfb1、Tgfb2、Aldh1a2和Pdl1表达。在LPS处理的BMDCs中，赖氨酸增强 Tgfb1、Aldh1a2和Pdl1表达，但不影响促炎基因表达。用赖氨酸或 PBS 处理从小鼠肠系膜淋巴结（MLNs）分离的 DCs，然后在诱导调节性 T 细胞（Treg）的条件下与初始T 细胞共培养，发现赖氨酸处理的 DCs显著增加CD4 +初始T 细胞向 Treg 细胞的分化，且增强 BMDCs 诱导Treg细胞分化的能力但不影响其增殖。用卵清蛋白（OVA）刺激的 BMDCs 与来自OTII小鼠的OVA特异性 CD4 + T 细胞共培养，发现赖氨酸显著促进 OVA 特异性Treg细胞分化。对肠道中DCs的主要亚群 CD103 + cDC1s和cDC2s进行分选，经赖氨酸处理后与幼初始T细胞共培养，结果显示赖氨酸增强 CD103 + cDC1s 和 cDC2s 促进Treg细胞分化的能力。综上，赖氨酸可促进DCs的致耐受性特征，刺激Treg细胞生成。
图二 赖氨酸可减轻多种小鼠模型中的炎症
作者在给予小鼠葡聚糖硫酸钠（DSS）处理2天后，每日灌胃100毫克/千克的赖氨酸，以此研究赖氨酸对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。通过体重变化、疾病活动指数、结肠长度和组织病理学评分评估发现，赖氨酸灌胃可保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎侵害。此外，赖氨酸处理显著降低了结肠中促炎细胞因子基因的mRNA水平，这些基因包括白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、诱导型一氧化氮合酶等。赖氨酸处理改善了肠道屏障功能。为探究赖氨酸对处于稳态的肠道免疫细胞的影响，用赖氨酸或PBS处理小鼠7天，然后检测免疫细胞。结果显示，赖氨酸增加了MLNs和cLP中的CD103+DCs以及MLNs中的Treg细胞，且不影响Th1 / Th2 / Th17细胞。
此外，作者探究了赖氨酸对结肠炎的保护作用是否独立于肠道微生物群。先用由氨苄青霉素、万古霉素、新霉素和甲硝唑组成的广谱抗生素鸡尾酒（ABX）预处理小鼠5天，以清除肠道固有细菌，然后在给予DSS 2天后灌胃赖氨酸。结果显示，这些小鼠的组织学评分更低、体重减轻更少、DAI评分更低且结肠更长。为研究赖氨酸在肠道外的作用，通过用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55免疫小鼠并给予赖氨酸灌胃，诱导小鼠发生实验性自身免疫性脑脊髓炎。与PBS组相比，赖氨酸延迟了EAE的发病，且不影响体重。赖氨酸处理降低了干扰素（IFN）-γ +和白细胞介素-17A +致病性CD4+T细胞的水平。迟发型超敏反应（DTH）是一种由DC介导的与Th1和Th17反应相关的免疫反应。小鼠皮下注射与完全弗氏佐剂（CFA）乳化的甲基化牛血清白蛋白后，在再次给予mBSA刺激前，用赖氨酸或PBS灌胃小鼠。与PBS处理相比，赖氨酸处理减轻了DTH的严重程度。此外，在赖氨酸处理的小鼠脾脏中，Treg细胞增加，Th1和Th17细胞减少。为评估赖氨酸给药的安全性，作者用赖氨酸灌胃小鼠4周。结果发现，对小鼠体重、结肠长度以及结肠、肺、肝和肾的组织病理学均无影响。赖氨酸灌胃显著增加了小鼠外周和粪便中的赖氨酸含量。此外，对赖氨酸或PBS处理小鼠的粪便细菌DNA进行了16S rRNA基因测序。两组在α多样性、β多样性或属水平的群落丰度上均无显著差异。综上所述，赖氨酸可增加肠道内外微环境中的CD103+DCs和Treg细胞，并保护小鼠免受多种免疫紊乱疾病的侵害，如结肠炎、EAE和DTH。
图三 赖氨酸调控的树突状细胞可预防小鼠患结肠炎
为探究赖氨酸对结肠炎的保护作用是否依赖于树突状细胞（DCs），作者使用了经白喉毒素（DT）诱导DC耗竭的小鼠。与对照组相比，在DC耗竭的小鼠中，赖氨酸处理对DSS诱导的结肠炎并无影响。这些结果表明，赖氨酸对DSS诱导的结肠炎的保护作用需要DCs的参与。此外，还研究了赖氨酸调控的DCs是否能促使结肠炎缓解。将经赖氨酸或PBS处理的CD45.1+骨髓来源树突状细胞（BMDCs）在诱导调节性T细胞的条件下与初始T细胞共培养，然后转移至CD45.2+小鼠体内，并在2天后给予3% 的DSS处理。与对照组和PBS处理组相比，赖氨酸处理组小鼠体重减轻更少，疾病活动指数（DAI）得分更低，结肠更长，组织学评分也更低。此外，转移经赖氨酸处理的CD45.1+BMDCs和Treg细胞抑制了结肠中促炎细胞因子的表达。而且，在赖氨酸处理组中，肠系膜淋巴结（MLNs）中的CD45.1+Treg细胞和总Treg细胞数量增加。因此，赖氨酸诱导的DC-Treg细胞耐受性可缓解小鼠的结肠炎症状。
图四 全文摘要示意图
总结
文章围绕肠道细菌产生的L-赖氨酸对树突状细胞耐受性及相关免疫反应的影响展开研究，肠道细菌产生的L-赖氨酸通过重新编程树突状细胞的单羧酸代谢和组蛋白甲基化，将树突状细胞分化为耐受状态，从而在炎症性疾病中恢复稳态。这一发现揭示了细菌代谢产物诱导DC耐受性的机制。。
文章来源
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.115125
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