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动物行为学实验是神经科学研究领域的重要组成部分，主要侧重于科学客观地评价各种条件下的动物行为。动物行为学实验种类繁多，研究不同的疾病模型时，研究人员需根据关注的具体行为选择合适的研究手段。《动物行为实验手册》为学习记忆类、抗焦虑抑郁类、抗疲劳类、神经精神类、痛觉测试类、嗅觉测试类、社会行为类及特定行为评估类等，其中许多实验需要借助特制的仪器、记录及分析系统。
2024年12月23日，华中科技大学公共卫生学院营养与食品卫生学系杨学锋团队在Journal of Neuroinammation发表“Accumulated BCAAs and BCKAs contribute to the HFD-induced deterioration of Alzheimer’s disease via a dysfunctional TREM2-related reduction in microglial β-amyloid clearance”，揭示了累积的BCAAs和支链BCKAs通过与TREM2功能失调相关的小胶质细胞Aβ清除减少，导致高脂饮食诱导的阿尔茨海默病病情恶化。
高脂饮食（HFD）会诱发肥胖和胰岛素抵抗，这可能在阿尔茨海默病（AD）进展过程中加剧Aβ病变。支链氨基酸（BCAAs）在肥胖或胰岛素抵抗的患者及动物模型中发生累积。然而，累积的BCAAs及其代谢产物支链α-酮酸（BCKAs）在高脂饮食诱导的AD病情恶化中所起的作用以及潜在机制，在很大程度上仍不明确。在本研究中，给APP/PS1转基因小鼠喂食高脂饮食6个月，并将高脂饮食中的BCAAs含量调整为200%或50%，以确定BCAAs的影响。喂食高脂饮食的APP/PS1小鼠在血清和大脑皮层中积累了BCAAs和BCKAs，同时出现了更严重的认知缺陷和AD相关病变。额外补充或限制BCAAs的摄入，会使这些现象加剧或逆转。BCAAs和BCKAs在体内及BV2细胞中抑制了小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，这可能与髓系细胞触发受体2（TREM2）功能障碍和自噬缺陷有关。研究结果表明，累积的BCAAs和BCKAs通过TREM2功能减退介导小胶质细胞中Aβ清除紊乱，从而促使高脂饮食加速AD进展。降低BCAAs和BCKAs水平可能成为AD一种潜在的饮食干预手段。
图一 高脂饮食喂养会诱发APP/PS1小鼠的胰岛素抵抗，并扰乱其支链氨基酸的分解代谢
APP/PS1小鼠在约6月龄时大脑中开始出现进行性的Aβ沉积，8 - 9月龄时出现认知缺陷。在本研究中，对3月龄的APP/PS1小鼠喂食高脂饮食6个月，以探究高脂饮食对Aβ病理和认知功能的影响。此外，给APP/PS1小鼠提供调整了BCAAs含量（增加100%或减少50%）的高脂饮食，以探究BCAAs在这一进程中的作用。各组之间的能量摄入没有显著差异。与普通饮食组相比，高脂饮食组、高脂饮食+ BCAAs组和高脂饮食-BCAAs组的APP/PS1小鼠体重、空腹血清葡萄糖水平、血清胰岛素水平和稳态模型胰岛素抵抗指数均有所增加，口服葡萄糖耐量试验表明其葡萄糖耐量受损。在高脂饮食组和高脂饮食额外添加BCAAs组的APP/PS1小鼠中，还检测到血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平升高。这些结果表明，高脂饮食喂养诱导了APP/PS1小鼠肥胖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱。然而，高脂饮食组、高脂饮食 + BCAAs组和高脂饮食-BCAAs组小鼠的体重没有显著差异。与高脂饮食喂养的小鼠相比，调整高脂饮食中的BCAAs含量对APP/PS1小鼠的食物摄入、胰岛素抵抗和脂质代谢没有明显影响。BCAAs能够通过L型氨基酸转运体穿过血脑屏障，维持中枢神经系统的功能。然而，高脂饮食对AD大脑中BCAAs代谢的影响在很大程度上仍不清楚。
在此，通过超高效液相色谱串联质谱法对APP/PS1小鼠血清和大脑皮层中的氨基酸水平进行了定量分析。与普通饮食喂养的小鼠相比，高脂饮食喂养的APP/PS1小鼠血清中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及其相应代谢产物的水平升高，同时谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的水平也出现差异。高脂饮食喂养引发了大脑皮层中BCAAs（缬氨酸除外）和BCKAs的积累。高脂饮食中添加或限制BCAAs在不同程度上改变了APP/PS1小鼠血清和大脑皮层中BCAAs和BCKAs的浓度。与普通饮食喂养的小鼠相比，高脂饮食喂养小鼠肝脏和骨骼肌中BCAT2的蛋白水平没有变化，而BCKDK的过表达使BCKDH的磷酸化比例增加。高脂饮食喂养降低了海马体和大脑皮层中BCAT2的蛋白水平，蛋白质免疫印迹法显示大脑皮层中BCKDH发生过度磷酸化。这些结果表明，高脂饮食喂养后，外周和脑组织中BCAAs的分解代谢受到抑制，且不受高脂饮食中BCAAs浓度调整的影响。总之，作者发现高脂饮食会损害APP/PS1小鼠的BCAAs代谢，导致血清和大脑皮层中BCAAs和BCKAs积累。大脑皮层中BCAAs和BCKAs水平的升高不仅与大脑中BCAAs降解的抑制有关，还与循环中水平的升高有关。
图二 在高脂饮食喂养的APP/PS1小鼠中，BCAAs的添加与限制，会影响认知缺陷的发展以及与AD相关病理变化
多项研究表明，HFD会通过代谢紊乱，在AD发展过程中加剧认知缺陷以及与AD相关的病理变化。然而，HFD诱导的支链氨基酸代谢紊乱是否参与这一进程尚未得到证实。因此，作者利用Morris水迷宫实验测试了APP/PS1小鼠的空间学习与记忆能力，并通过免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹法评估了与AD相关的病理变化。HFD组的APP/PS1小鼠在Morris水迷宫中训练阶段的逃避潜伏期更长，以及在探索实验中进入目标平台位置和目标象限的次数更少。重要的是，额外摄入BCAAs进一步加重了空间学习和记忆缺陷；相反，限制BCAAs摄入则逆转了HFD喂养小鼠的这些缺陷。此外，大脑皮层中的BCAAs和BCKAs水平与APP/PS1小鼠的认知功能呈负相关。与普通饮食喂养相比，HFD喂养的APP/PS1小鼠大脑中的突触损伤。在HFD中添加或减少BCAAs含量分别加剧或缓解了大脑皮层中的突触后损伤。此外，限制BCAAs摄入还改善了突触前损伤。大量证据表明，在AD发展过程中，突触损伤发生在Aβ积累之后。HFD组小鼠大脑中的Aβ沉积比普通饮食组小鼠更多。HFD喂养小鼠的Aβ负荷因BCAAs的添加或限制而分别增加或减少。总Aβ1 - 40和Aβ1 - 42的酶联免疫吸附试验结果与免疫荧光结果呈现相似趋势。然而，所有组之间大脑皮层中淀粉样前体蛋白和APP加工分泌酶的蛋白水平没有显著差异，这表明Aβ的产生保持不变。这些研究结果表明，积累的BCAAs和BCKAs促进了HFD诱导的APP/PS1小鼠认知缺陷、突触退化和Aβ病理变化的发展。
图三 BCAAs和BCKAs影响小胶质细胞中TREM2以及自噬对Aβ的反应
接下来，作者探究了BCAAs和BCKAs如何影响小胶质细胞对Aβ的吞噬作用。TREM2作为一种可被细胞外Aβ激活的跨膜受体，对小胶质细胞对Aβ的反应至关重要。同时，小胶质细胞的自噬作用有助于清除Aβ。BCAAs和BCKAs作为mTORC1激活剂会阻断自噬活性，而自噬缺陷被认为会导致TREM2调节异常。与普通饮食喂养相比，高脂饮食喂养降低了APP/PS1小鼠中SYK的磷酸化水平，但未改变TREM2的水平，这表明TREM2的激活受到抑制。与高脂饮食喂养的小鼠相比，随着BCAAs摄入量增加，高脂饮食喂养小鼠的TREM2蛋白水平降低，而SYK的磷酸化进一步受到抑制。另一方面，限制BCAAs摄入可恢复TREM2的激活。此外，在高脂饮食 + BCAAs组中，TREM2相关蛋白DAP12和吞噬体标志物CD68的mRNA水平降低。高脂饮食组小鼠大脑皮层中的mTORC1被激活，自噬活性降低，这表现为磷酸化S6K蛋白和P62蛋白水平升高、LC3-I向LC3-II的转化减少，以及LAMP1的mRNA水平降低。高脂饮食中BCAAs含量的增加或减少，对APP/PS1小鼠大脑皮层的自噬作用产生相反的影响。作者之前报道过，用BCAAs或BCKAs干预4至12小时，BV2细胞对Aβ的吞噬作用会发生变化。用Aβ和BCAAs/BCKAs处理BV2细胞4小时和12小时，随后进行蛋白质免疫印迹分析，以确定TREM2和自噬是否参与BCAAs和BCKAs对小胶质细胞吞噬Aβ的影响。结果显示，用BCAAs或BCKAs处理4小时后，BV2细胞中TREM2对Aβ的反应减弱，但未检测到自噬或TREM2蛋白水平的变化。处理BV2细胞12小时后，BCAAs或BCKAs导致自噬缺陷和TREM2蛋白水平下调。
综上所述，研究发现，累积的BCAAs及其代谢产物BCKAs在高脂饮食诱导的AD早期病理阶段加重了病情。具体机制是BCAAs和BCKAs通过使TREM2功能失调来破坏小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，其中可能涉及TREM2结合与自噬过程。这些证据为理解饮食引起的代谢异常与AD进展之间的关系提供了理论基础，并支持通过饮食预防干预措施来减缓AD的发展。针对BCKDK（支链酮酸脱氢酶激酶）的抑制剂（如BT2），可以有效降低BCAAs水平，显示出作为未来AD治疗中有潜力的药物策略。
文章来源
https://doi.org/10.1186/s12974-024-03314-1
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