【导读】化疗耐药是治疗胃癌（GC）过程中面临的重大临床挑战，但其潜在的分子机制尚未完全阐明。
12月20日，西南大学与温州医科大学研究人员合作共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了题为“Targeting TRAF6/IRF3 axis to inhibit NF-κB-p65 nuclear translocation enhances the chemosensitivity of 5-FU and reverses the proliferation of gastric cancer”的研究论文，本研究探讨了TRAF6在5-FU耐药胃癌中的作用。研究人员利用体外和体内模型抑制5-FU耐药胃癌细胞中的TRAF6表达，研究人员观察到细胞增殖和肿瘤生长明显减少。TRAF6低表达抑制了NF-κB-p65的核转位，这是通过促进IRF3的表达实现的。值得注意的是，TRAF6是一种泛素连接酶，它与IRF3-Δ (SR + IAD) (1-190 aa) 域结合，诱导IRF3的Lys70位点的泛素化，以调节其蛋白质稳定性，其中K48残基在该过程中起着关键作用。总之，本研究揭示了TRAF6/IRF3轴通过促进NF-κB-p65的核转位而降低GC细胞对5-FU的敏感性，为克服胃癌化疗耐药提供了有价值的见解。
https://www.nature.com/articles/s41419-024-07290-5
背景信息
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胃癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤。根据2022年的数据，胃癌在全球范围内的发病率和死亡率均排名第五，其中死亡病例占新病例的近70%。目前，手术被广泛用于胃癌各阶段的主要治疗手段。化疗是胃癌术前和术后干预以及晚期胃癌（局部癌症无法切除、复发或转移）患者不可或缺的治疗手段，旨在达到抑制癌症进展的目的。
5-FU被定义为一种干扰癌细胞生长的氟尿嘧啶类衍生物。它需要在体内转化为活性代谢物才能发挥治疗作用。作为胃癌的一线化疗药物，5-FU在临床治疗方面取得了很大进展，但患者的5年生存率仍然很低。这主要是由于先天性或获得性耐药的存在，阻碍了药物的有效性。目前，胃癌中5-FU耐药的潜在机制尚不清楚，降低化疗耐药是改善总体生存率的主要挑战。因此，迫切需要在分子水平上寻找靶点，以使一些胃癌患者受益。
研究表明，肿瘤化疗耐药性与泛素化修饰有关。TRAF6是一种含有RING结构域的E3泛素连接酶，在适应性免疫和固有免疫以及自噬过程中发挥作用。它还广泛参与泛素化修饰的过程。TRAF6的过表达促进肿瘤生长，导致对放疗和化疗的不良反应。例如，TRAF6诱导AKT发生泛素化，加速口腔癌的进展，并诱导P53发生K63泛素化，促进肿瘤生长和耐药性。此外，TRAF6的激活在NF-κB信号通路中也发挥着重要作用。尽管越来越多的研究强调TRAF6在肿瘤调节中的作用，但TRAF6在化疗耐药肿瘤细胞中的特定泛素化机制尚不清楚。
TRAF6缺失会抑制5-FU耐药的GC细胞的增殖并阻止其细胞周期进展
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为了研究TRAF6对5-FU耐药GC细胞的影响，研究人员对对照组和TRAF6敲低细胞进行了MTT检测、克隆实验、EdU检测和流式细胞术分析。结果显示，TRAF6敲低显著影响了BGC-823-R和SGC-7901-R两种耐药GC细胞的增殖。5-FU耐药GC细胞的克隆能力在TRAF6敲低后显著受到抑制。EdU检测显示，与对照组相比，敲低TRAF6显著降低了EdU阳性细胞的比例。流式细胞术显示，TRAF6敲低细胞的细胞周期主要被阻滞在G2/M期。同样地，TRAF6敲低后，相关细胞周期蛋白CDK1和Cyclin A2的表达水平降低。这些结果表明，TRAF6对于5-FU耐药GC细胞的增殖至关重要。
TRAF6缺失会抑制5-FU耐药的GC细胞的增殖并阻止其细胞周期进展
TRAF6在体外促进5-FU耐药GC细胞的克隆，并在体内促进肿瘤生长
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接下来，为了检测TRAF6对5-FU耐药GC细胞肿瘤发生的影响，研究人员通过软琼脂培养基实验在体外测试了表达shGFP或shTRAF6的5-FU耐药GC细胞的肿瘤发生能力。结果显示，实验组的结节数量和大小均少于对照组。这一发现在体内肿瘤发生实验中得到了进一步支持，将TRAF6敲除的BGC-823-R和SGC-7901-R细胞通过皮下注射植入免疫缺陷小鼠体内。30天后，与对照组相比，TRAF6敲除组的皮下肿瘤生长速度较慢，体积和重量较小。研究人员探索了TRAF6是否通过促进5-FU耐药GC细胞的增殖来驱动肿瘤进展。对切除的小鼠肿瘤进行免疫组织化学染色显示，与TRAF6敲除组相比，TRAF6表达和Ki67表达在肿瘤组织中显著降低，这清楚地证明了TRAF6促进了5-FU耐药GC细胞的肿瘤发生。
IRF3表达降低促进了TRAF6敲除的5-FU耐药GC细胞的增殖和肿瘤生长
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之前，研究人员已经证明TRAF6与IRF3之间存在相互作用，两者之间存在反向调节关系。接下来，研究人员旨在确定TRAF6介导的5-FU耐药GC细胞的增殖和肿瘤生长是否受到IRF3的影响。研究人员通过稳定敲低TRAF6（shTRAF6）和IRF3（shIRF3）来敲低5-FU耐药GC细胞中的IRF3表达，并检测TRAF6和IRF3的表达。MTT和EdU试验显示，与对照组相比，双敲低组的细胞生长速度更快，EdU阳性率更高。克隆形成实验证明，shTRAF6/shIRF3显著恢复了细胞克隆能力。皮下异种移植实验表明，5-FU耐药GC细胞的肿瘤生长速度、体积和重量得到了恢复。免疫组化分析显示，在TRAF6敲低细胞中，IRF3下调后Ki67阳性率得到了恢复。IRF3的阳性率与对照组相似，但TRAF6的阳性率不受IRF3敲低的影响。所有数据表明，IRF3是TRAF6的底物蛋白，其缺失对于TRAF6促进5-FU耐药GC细胞的增殖至关重要。
根据这些发现，研究人员总结了调控5-FU耐药GC细胞的TRAF6/IRF3轴模型：TRAF6通过与IRF3-Δ（SR+IAD）（1-190aa）结合，诱导IRF3的Lys70泛素化，促进IRF3蛋白的降解，增加NF-κB-p65的核转位，最终促进5-FU耐药GC细胞的增殖和肿瘤发生。
研究意义
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本研究揭示了TRAF6在5-FU耐药胃癌细胞增殖中的重要作用，靶向TRAF6进行治疗是一种有前景的癌症治疗和克服耐药的策略。
【参考资料】
https://www.nature.com/articles/s41419-024-07290-5
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