1927年，遵照中共中央军委书记周恩来的指示，叶挺积极收容外地因受反革命势力迫害而跑来武汉的革命分子，充实部队各级骨干力量。二十四师是我党控制的武装力量，叶挺同志是师长。当时各地进步的人多遭通缉或追捕。
为了收容两湖地区的被迫害的青年学生和工人，培养未来的下层军事干部，在二十四师成立了教导队。不到半月，就有1000多名学员几乎是清一色的党、团员。除了上政治课外，还经常请负责同志如周恩来、恽代英、瞿秋白、叶挺等同志来作报告。
1927年7月12日，中共中央召开紧急会议，毅然排除了陈独秀的错误领导，成立了由周恩来、张太雷、李维汉、李立三及张国焘等人组成的中央临时政治局常务委员会，当即作出了在湘、鄂、赣、粤四省发动秋收暴动的决定。
中央常委会还获悉九江方面张发奎控制的部队也日趋反动，因此又决定叶挺、贺龙的部队于九江、南昌一带举行武装起义。据周恩来回忆：“八一起义前，几个临时负责人瞿、张和我就酝酿起义。当时动员的有叶挺的十一军和贺龙的两个师”。
1927年7月15日，汪精卫集团终于公开叛变了革命。1927年7月20日左右，谭平山在九江召开会议，叶挺、邓中夏、李立三、聂荣臻等人参加。叶挺亦参加了其中一些会议，表示坚决拥护举行武装起义以反抗国民党反动派的屠杀政策。
中共中央决定组成以周恩来为书记的前敌委员会，作为这次起义的领导核心，周恩来随即从武汉赶到南昌，传达党中央关于起义的决定，并具体筹划武装起义的进行。
第二十军和第二十四师这两支部队日益激烈的革命情绪，引起了反动派的严重注意。这时，张发奎、朱培德等国民党军事头目也麇集于九江、庐山一带，阴谋调动亲信部队包围并消灭叶、贺部队。
张发奎还以二方面军总指挥名义，通知叶挺、贺龙去庐山开会，企图乘机解除他们的军权。但这一阴谋为正在第四军任参谋长的叶剑英所知悉。
1927年7月25日，叶剑英秘密约叶挺和贺龙到鄱阳湖中一艘小船上开会，将上述情况告诉他们。经过缜密研究，决定叶、贺既不上庐山，也不接受张发奎关于将队伍集中于德安的命令。决定叶挺部乘贺龙的火车于翌日即赴南昌，贺龙部队于第三天也开赴南昌，参加起义。
经过十分紧张的准备，同时又排除了张国焘企图阻挠起义，决议仍主张于八月一日发动，由贺龙、叶挺、谭平山、周恩来组织国民党内的特别委员会，主持这个运动”。
根据党的指示，叶挺于1927年7月31日起草了作战命令：“我军为达到解决南昌敌军的目的，决定于1927年8月1日4时开始向城内外所驻敌军进攻，一举而歼之!”
叶挺回部队后，立即召开全师营以上干部会议，向大家传达党的决定。他说：“宁汉合作已成定局，国民革命遭到了严重的危机。中央决定实行武装起义来挽救目前的危局，粉碎反革命的阴谋。这次行动的具体任务，就是占领南昌城，彻底消灭南昌城关内外的反革命军队”。
1927年8月1日凌晨，震惊中外的南昌起义爆发了。叶挺指挥的二十四师负责解决敌第六军五十七团和第三军两个团。他与周恩来一起在敌人驻守顽抗的松柏巷天主堂附近的一间女子学校里，指挥部队与敌人激烈战斗，终于迫使敌人缴械投降。
其余各部也顺利地完成了任务。1927年8月1日上午，起义获得成功。这次起义，打响了反对国民党反动派的第一枪，开创了中国共产党独立领导革命战争和创建革命军队的新时期。
起义胜利后，部队仍沿用国民革命军第二方面军的番号，由贺龙任二方面军总指挥，叶挺任代理前敌总指挥，刘伯承任参谋长，部队整编为第二十军、第十一军和第九军三个军；叶挺兼第十一军军长、聂荣臻任第十一军党代表，下辖二十四师、二十五师及第十师等部。二方面军成立军事委员会，以贺龙、叶挺为军事委员会委员，周恩来亦为军事执行委员。
1927年8月1日上午9时，参加起义的共产党领导人和国民党左派进步人士举行联席会议，首先由叶挺报告起义经过，然后议决成立革命委员会，推选叶挺在内的25人为革命委员会委员，公布了《八一起义宣言》、《八一起义宣传大纲》、《中央委员宣言》等文件。
1927年8月2日，革命委员会于南昌皇殿侧体育场召开的有5万人参加的庆祝起义胜利的群众大会，大会主席团由贺龙、叶挺、恽代英及各界代表组成。
叶挺的名字，作为这次起义的重要领导人之一，与周恩来、贺龙、朱德等一起，记载在中国革命的光辉史册上。从1927年8月3日起，起义部队在周恩来、叶挺等领导人的率领下，离开南昌南下广东，打算重建广东革命根据地。
当时正值炎夏时节，天气酷热，战士们背着沉重的武器和被服等行军，行军途中，叶挺把自己的马匹让给病号骑，与战士们一起徒步行军，同甘共苦，使战士们受到很大鼓舞。南昌起义部队沿临川、广昌南下，8月下旬抵达瑞金。
在这里得知敌人于会昌屯驻重兵，企图堵截和消灭起义部队；同时还查获了一份敌人攻击起义军的部署。当时敌右路钱大钧部集结于会昌一带；左路黄绍竑部则集结于会昌西北之于都一带，与钱部形成犄角之势。
前委讨论对策时，周恩来、叶挺、贺龙及刘伯承等主张攻击歼灭会昌之敌；苏联顾问纪功等则主张避免与敌人接触，绕过敌人。讨论结果，大多数认为不管怎样走法，都必须首先歼灭会昌之敌。
前委乃决定由叶挺指挥所部经洛口向会昌西北之敌进攻；朱德指挥一支部队向会昌东北面助攻；由贺龙率所部为总预备队，位于瑞金附近，策应支援各方。
1927年8月30日，部队总攻开始。朱德指挥教导团等部进抵会昌城东北，与敌人展开激战。叶挺率二十四师进占洛口后，随即进抵会昌西北郊。前委总指挥部领导人周恩来、刘伯承、聂荣臻等与叶挺均在二十四师指挥部指挥作战。
战斗打响后，担任后卫的二十五师迟迟未到，原来他们半夜行军时迷路，发现迷路后又折回来赶向会昌，以致延至中午时分才赶到。叶挺当即向他们布置任务，命令他们迅速夺取位于会昌城西北的岚云岭主峰，突破敌人的西北防线。
二十五师投入战斗后，各部队也猛烈地向敌人展开进攻，激战至下午4时，终于将敌人击溃，起义军攻占了会昌。翌日，黄绍竑部不知钱大钧部已被打垮，仍从洛口前来会昌增援。
叶挺命令二十四师、二十五师往城西北迎敌，将敌人赶了回去。在这次会昌战斗中，叶挺沉着果敢，指挥有方，又一次表现了卓越的军事指挥才能。刘伯承对此十分钦佩。他后来曾对别人说：“没有见过一个军人在兵临城下万分危急时刻，能够像叶挺那样沉着。”
起义军打破钱大钧、黄绍竑等部的阻挡后，周恩来、叶挺等主张主力经寻乌出梅县、兴宁、五华，直取惠州，控制东江地区。但另一部分同志则主张攻取潮汕，占领海口，等待国际援助。由于后一种意见占上风，于是决定除留下朱德率领二十五师扼守三河坝外，主力南下潮汕。
1927年9月24日，叶挺的二十四师和贺龙的二十军一、二师等三个师，攻占了汕头。26日，汕头数万工农群众举行欢迎南昌起义部队大会，周恩来、叶挺、贺龙等参加大会与群众见面。
全场响起了一阵阵热烈的欢呼声。由于当时形势日益险恶，叶挺提议放弃潮汕，集中我们的兵力，并将多余空枪悉运至海陆丰一带交给农民，但此提议因负责同志不赞成而未被采纳。
起义部队又进行了第二次分兵：由周逸群率领二十军第三师留守潮汕，两个军的主力在贺龙、叶挺率领下向揭阳进发。此时，敌人已在揭阳的汤坑一带高山有利地形处集结了大量兵力。
1927年9月30日，起义军退至揭阳，途中获悉潮汕失守，便于10月2日渡过榕江撤至贵屿；10月3日，由贵屿到普宁流沙，与从潮汕撤退出来的部队会合。
当天，前委在流沙召开会议，对今后的斗争作出决策。叶挺参加了这次会议。周恩来在会上作了报告，从政治上和军事上总结了这次起义的经验教训，指示部队退往海陆丰作长期的革命斗争。
叶挺还表示自己要亲自到海陆丰树起苏维埃的红旗。会后，恽代英、林伯渠、吴玉章等分别从汕头、甲子港和神泉等地转移到香港、上海等地进行秘密工作。
刘伯承按照中共中央的指示到苏联学习军事。周恩来和叶挺、聂荣臻在汕头市委书记杨石魂陪同下，转移到陆丰县南塘区黄厝寮村黄秀文家。这时周恩来正患病，发高烧。他们在黄秀文家住了半个月，后在当地党组织的安排下，乘船到了香港。