原名 Anti-inflammation mechanisms of a homogeneous polysaccharide from Phyllanthus emblica L. on DSS induced colitis mice via the gut microbiota and metabolites alteration
译名 余甘子 Phyllanthus L. 均一多糖通过肠道菌群和代谢物改变对 DSS 诱导的结肠炎小鼠的抗炎机制
期刊：Food Chemistry
IF：8.5
中科院分区：1区/Q1
发表时间：2024.7
导读
炎症性肠病（IBD）是一种严重且持久的疾病，分为溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），其病因复杂，受遗传、环境和肠道菌群影响。近年来发现肠道菌群稳态与IBD进展密切相关。多糖具有多种生物活性，可通过调节肠道菌群等方式改善IBD。余甘子（Phyllanthus emblica）具有多种功效，之前研究已表明其具有抗炎特性并有成为天然治疗剂的潜力。然而，对于从余甘子中纯化出的均一多糖（PEP - 1）的结构及其对UC的抗炎机制尚未明确。本研究旨在纯化PEP - 1并揭示其分子结构，通过在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎症模型中研究肠道代谢物和肠道细菌，来探究其抗炎机制，进一步探索肠道微生物组变化、功能途径和粪便代谢物变化之间的关系，以增进对膳食纤维、肠道细菌和代谢物如何调节UC的理解。
研究方法
研究结果
1. PEP-1 的分子量测定和形态特征
HPGPC 分析表明，PEP-1 是一种均相多糖，因为峰形对称尖锐（图 S1a）。PEP-1 的分子量为 3.67 × 106，苯酚-硫酸法显示 PEP-1 的总碳水化合物为 92.5%。测定糖醛酸和蛋白质含量分别为 68.7% 和 0.98%。SEM 分析表明，PEP-1 的微观结构相对致密和光滑。在低放大倍率下，PEP-1 呈片状，具有聚集分布和不同的大小。在高倍率下，可以确定该结构相对紧密光滑，表面无孔，表明PEP-1具有较强的分子间作用力和紧密的结合力（图1c & 1d & 1e）。致密的结构和强大的分子间作用力可能有助于 PEP-1 的抗消化能力，使其能够转移到结肠进行发酵。
2. PEP-1 的 FT-IR 和单糖组成分析
如图 1a 所示，3407 和 2937 cm 的条带−1可归因于 O-H 和 C-H 的拉伸振动（邓等人，2020 年）。1749 和 1621 cm 的明显山峰−1分别表明存在 CO=和游离羧基，这意味着 PEP-1 存在糖醛酸。带 1417 cm−1可以分配给 CH-的角度振动。而弱峰在 1243 至 1336 cm 处−1被分配给 CH的拉伸振动 。在 950 至 1200 cm 范围内有明显的信号−1，分别对应于 C-O 和 C-C 拉伸和 C-OH 弯曲的存在，而 1022 cm 处的表观峰值−1 表明 PEP-1 具有吡喃糖形式的糖苷。值得注意的是，919 和 833 cm 处的峰值较弱−1 表明 PEP-1 的结构有两种糖苷键（α 和 β 糖苷键）。离子色谱检测表明PEP-1 由阿拉伯糖 （Ara）、半乳糖 （Gal）、葡萄糖 （Glc）、木糖 （Xyl） 和半乳糖醛酸 （GalUA） 五种单糖组成，摩尔比为 0.066：0.096：0.043：0.017：0.778。特别是高比率 GalUA 的存在对应于上述 FI-IR 分析。
3. GC-MS 对 PEP-1 进行甲基化分析
在 PEP-1 中检测到 8 个糖苷键，分别为 t-Ara（f）、t-Gal（p）-UA、4-Gal（p）-UA、4-Glc（p）、3,4-Gal（p）-UA、2,4-Gal（p）、4,6-Gal（p） 和 4,6-Gal（p），相对摩尔比为 4.38：5.60：71.72：9.36：2.83：1.15：1.15：3.80。其中，4-Gal（p）-UA 在 PEP-1 中占所有糖苷键的最高比例，高达 71.72%。
4. PEP-1 的 NMR 分析
为了阐明 PEP-1 结构，1D （1H 和13C） 和 2D （COSY、HSQC 和 NOESY） NMR 谱图用于分配单糖的特征峰信号。在1H 和13C，可以观察到δ 1.80-2.10 ppm 和 δ 21.30-21.96 ppm 的区域（图 2a 和 2b），这归因于乙酰甲基质子/碳的特征信号。结合 PEP-1 的单糖，可以排除岩藻糖的存在。此外，在 4.40-5.10 ppm δ和 δ 94-112 ppm 中可以观察到异头质子/碳区域。值得注意的是，δ 110.24 ppm 归因于 Araf 的特征峰信号。此外，在 δ 65–70 ppm 的区域观察到明显的信号，表明糖残基的 C-6 与其他糖残留物有关。结合 PEP-1 的甲基化结果，δ 65-70 ppm 的特征峰信号可以分配给 4,6-β-D-Gal （p）。在 COSY NMR 波谱中（图 2c），可以在 4.40-5.10 ppm 的δ观察到异常区域。这些显著信号被分配给所有糖残差的 H1/H2，包括δ 5.10/3.90 ppm、δ 4.52/3.51 ppm、δ 4.52/3.64 ppm、δ 4.69/3.67 ppm、δ 4.83/3.57 ppm、δ 4.52/3.57 ppm、δ 4.52/3.69 ppm、δ 4.97/3.64 ppm 和 δ 5.02/3.89 ppm。有趣的是，在 4.52 ppm 附近显示出δ强信号，推测它是 Gal（p）-UA 和 Gal（p） 的异头碳，因为它在 PEP-1 的单糖构成中占比相对较高。结合甲基化结果和 HSQC，将 Gal（p）-UA 和 Gal（p） 的异常区域均δ 4.52/104.51 ppm。此外，Araf 的异头信号可以分配为 δ 5.10/110.24 ppm。表 1 中报告了糖残差的其他异常信号，分别命名为 A、B、C、D、E、F、G、H、I 和 J。结合文献和 HSQC NMR 波谱（图 2d），可以在δ 3.72/51.64 ppm 和 δ 3.72/54.09 ppm 中观察到显著的信号区域，表明甲氧基 （-O-CH3） 中。此外，甲氧基与羧基碳相连，这可以通过 HMBC 中 3.72/170.82 ppm 的信号δ证明（图 2f）。因此，残基 C 被认为是 4-β-D-Gal（p）-UA-6-OMe 。在NOESY光谱中，可以分配糖残差的信号，如AH1/H3（δ 5.10/3.87）、BH1/H3（δ 4.52/3.60）、CH1/H3（δ 4.52/3.53）、DH1/H4（δ 4.69/3.51）、EH1/H3（δ 4.83/3.69）、FH1/H2（δ 4.52/3.57）和GH1/H3（δ4.52/3.59） 等（图 2e）。来自 HMBC 频谱的信号太弱，无法分配。因此，通过甲基化结果和单糖构成推测 PEP-1 的结构。根据甲基化结果，与其他单糖相比，4-Gal（p）-UA 的残糖比例最高。因此，包括 3,4-β-D-Gal（p）-UA、2,4-β-D-Gal（p）、4,6-β-D-Gal（p） 和 4-β-D-Glc（p） 在内的糖残差可能分别与 4-β-D-Gal（p）-UA-6-OMe 相互作用。此外，4-β-D-Gal（p）-UA-6-OMe 可以与其他糖残基隔开，如图 2g 所示。
5. PEP-1 改善结肠炎小鼠症状
如图 3b 所示，对照组小鼠的体重增长速度比其他组快。模型组的体重增加最少，有时呈下降趋势。低剂量和高剂量的 PEP-1 给药减缓了 DSS 处理小鼠的体重减轻，表明 PEP-1 治疗改善了 DSS 引起的体重减轻。DAI 评分是公认的结肠炎严重程度标准。在模型组中，它远高于对照组 （p < 0.001），并且 PEP-1 给药显着降低了 DAI 评分 （p < 0.01） （图 3c）。脾指数和结肠长度通常用作结肠炎的典型指标 （Gong et al.， 2024）。如图3d & 3e & 3f所示，DSS干预增加了脾脏指数并降低了结肠长度，然而，在低剂量和高剂量的PEP-1组中，小鼠的脾脏指数降低，结肠长度的缩短显著逆转（p< 0.05）。所有这些结果表明，PEP-1 对小鼠的慢性结肠炎症发挥了保护作用。
6. PEP-1 对炎性细胞因子和血清生化指标的影响
血清 AST 和 ALT 水平表现为药物对肝脏的毒性。在这项研究中，血清AST和ALT在给予DSS和PEP-1后并未显示出显著变化，这表明在该实验中，1.5% DSS和PEP-1处理对肝脏没有明显的损害（图3g & 3h）。炎症细胞因子在 IBD 的发展中起着重要作用。检测细胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-10 的表达反映了炎症的状态和严重程度。IL-10 被认为是一种抗炎细胞因子，与模型组相比，其在 DSS 处理模型组中的结肠组织中的含量降低，而在 PEP-1 组中升高（图 3j）。相反，模型组血清的促炎细胞因子TNF-α和IL-6增加，而在给予PEP-1后下降（图3i & 3k）。细胞因子的检查表明，PEP-1 通过减少促炎细胞因子的过度释放和增加抗炎细胞因子的产生来维持免疫系统稳态。
7. PEP-1 改善了结肠组织的组织学变化
H&E 染色结果显示，与对照组相比，模型组可以清楚地观察到炎症浸润、隐窝缩短或缺失以及杯状细胞的缺乏。与对照组相比，模型组的肠粘膜变薄。粘液层在肠粘膜中起到有效的屏障作用，防止有毒有害物质进入体内。与模型组相比，PEPL 和 PEPH 组粘膜层变厚，炎性浸润和杯状细胞缺乏较少，组织学变化以剂量依赖性方式改善。所有这些组织学表现都表明 PEP-1 对慢性结肠炎症具有保护作用。
8. PEP-1 对肠道细菌的调节
微生物数据分析表明，与对照组和 PEP 组相比，模型组的业务分类单元 （OTU） 减少。PEPL 和 PEPH 组与对照组重叠的 OTU 比模型组多（168 和 144 对 105）（图 4a）。肠道细菌多样性由 α 和 β 多样性指数表示。以香农指数为特征的α多样性表明，DSS 给药显着降低了肠道微生物组多样性，而 PEP-1 治疗在一定程度上改变了这种下降（图 4c）。代表β多样性的主坐标分析 （PCoA） 和组距离的评估表明，模型和其他组之间的肠道菌群组成存在明显的变化。PEP组和对照组相对接近，表明PEP-1恢复了DSS给药引起的变化（图4b & 4d）。厚壁菌门和拟杆菌门是门水平上已确定的原发细菌群落，PEP-1 处理增加了 DSS 诱导的厚壁菌门的相对丰度下降（图 4e 和 4g）。与对照组相比，模型组拟杆菌门的丰富度升高，然而，低剂量和高剂量的 PEP-1 的使用显着逆转了这种变化（图 4h）。这种改变与之前关于 IBD 患者厚壁菌门种群下降和拟杆菌门增加的报告一致。在属级别上，发现模型组的Duncaniella和Phocaeicola比对照组有所增加，并且在PEP-1干预后下降，尤其是Phocaeicola（图4f & 4i & 4k）。相反，Muribaculum 和 Dubociella 属在模型组中减少，在 PEPL 和 PEPH 组中分别增加（图 4f 和 4j）。为了更具体地研究改变的细菌，我们探索了物种水平的差异（图5a & 5b & 5c）。Phocaeicola sartorii和Duncaniella muris在物种级别上对Phocaeicola和Duncaniella属的丰度变化贡献最大（图5d & 5g）。在模型组中，Alistipes shahii和Intestinimonas timonensis的丰富度也在模型组中上升，并在PEP处理后下降到接近对照水平（图5f & 5i）。因此，PEP-1 通过提高肠道微生物组的多样性来发挥作用，同时增加结肠炎症中有益细菌的丰度，降低有害细菌的丰富度。
为了研究 PEP-1 治疗对 DSS 诱导的结肠炎小鼠肠道菌群代谢物的调节作用，在正离子和负离子模型中使用了非靶向代谢组学。在粪便阳性和阴性模型下分别检测到 3900 和 892 种代谢物。通过 PCA 图评估代谢物的多样性。结果表明，每组样本都聚集成一个紧密的集群，模型组与其他 3 组分开。在阳性模式下，PEPL 和 PEPH 组与对照组有一定的重叠，在阴性模式下，与模型组相比，它们更接近对照组。这表明，在补充PEP-1后，DSS诱导的粪便代谢物的显著变化被逆转（图6g & 6h）。然后进行差异分析以识别 4 组间显着差异的代谢物，并通过火山图显示。在 LOG2 （FC） > 1 或 LOG2 （FC） < −1 和 p 值 <0.01 的基础上，1443、1263 和 1372 内源性代谢物分别被视为对照组与模型组、PEPL 与模型组和 PEPH 与阳性 HESI 模式下的模型组的差异代谢物（图 6a & 6b & 6同时，在阴性HESI模式下，对照组与模型组、PEPL与模型组和PEPH与模型组中分别鉴定出385、325和314种差异代谢物（图6d & 6e & 6f）。为了进一步区分关键的差异代谢物，根据峰面积对这 4 组中的差异代谢物进行排列，并采用 KEGG 和 SMPDB 数据库。筛选出 60 种差异代谢物的高峰面积，并位于主要途径中（表 S2）。为了直观地观察这些候选差异代谢物在四组中的表达，在 OmicStudio 网站上进行了分层聚类分析（图 6i）。根据粪便样本中代谢物的峰值评级生成热图。然后将差异代谢物上传到Metaboanalyst 6.0进行富集和通路分析，利用KEGG和SMPDB数据库（图6j & 6k & 6 l）。结果表明，差异代谢物主要参与以下途径：嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢和嘌呤代谢。与对照组相比，本研究中 DSS 模型组的胸苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶上调。然而，PEP-1 治疗逆转了这些代谢物的水平。
10. 粪便代谢物、肠道菌群和生化指数之间的关联
Dubosiella 属和 Muribaculum 属以及 Muribaculum sp002492595 种与结肠长度和 IL-10 呈正相关，与脾指数、DAI 和 TNF-α 呈负相关，可能参与抗结肠炎作用。相反，Duncaniella 属和 Phocaeicola 属，以及 Phocaeicola sartorii、Bacteroides thetaiotaomicron、Alistipes shahii、Duncaniella muris 和 Intestinimonas timonensi 属，与 IL-6 、脾指数、DAI 和 TNF-α 呈正相关，与结肠长度和 IL-10 呈负相关。这些细菌可能对结肠炎症起到促进作用。所有这些结果与肠道细菌丰富度的分析一致，表明这些细菌在模型组中上调，并在施用 PEP-1 后恢复到对照水平。代谢物脱氧胆酸和二十二碳六烯酸乙酯是 PEP-1 治疗组中上调最丰富的代谢物，与促炎细胞因子和 DAI 呈负相关，而与抗炎细胞因子 IL-10 和结肠长度呈正相关。同时，它们与本实验中促进炎症的细菌呈负相关。在 PEP-1 给药组中，下调的代谢物、gitogenin、α-亚麻烯酸、鸟氨酸、12,13-EpOM 和 4-吡哆酸与促炎细胞因子、DAI 和促进炎症的细菌呈正相关。这些结果表明，补充 PEP-1 诱导的肠道微生物群结构和丰度的变化促进了粪便代谢物和代谢途径的改变，从而有助于改善小鼠的结肠健康。由于先前的研究表明，甲酯化程度高的果胶减轻了啮齿动物柠檬酸杆菌诱导的结肠炎，因此推测具有抗结肠炎活性的特殊官能团与 Gal-UA 的高度甲酯化有关。
结论
在本研究中，使用来自 Phyllanthus Emblica L. 的水溶性且具有潜在活性的多糖治疗 DSS 诱导的小鼠慢性结肠炎症，以评估其抗结肠炎作用并探讨潜在机制。结构分析表明，PEP-1 由 Ara、Gal、Glu、Xyl 和 GalU 组成，摩尔比为 0.066：0.096：0.043：0.017：0.778。甲基化分析进一步显示，PEP-1 由 α-L-Ara（f）、β-D-Gal（p）-UA、4-β-D-Gal（p）-UA-6-OMe、4-β-D-Glc（p）、3,4-β-D-Gal（p）-UA、2,4-β-D-Gal（p）、4,6-β-D-Gal（p） 和 4-α-D-Gal（p）-UA 组成。体内研究表明，PEP-1 改善了缩短的结肠，提高了体重减轻，降低了 DAI，并改变了细胞因子的水平。此外，PEP-1 干预通过增强肠道细菌的多样性和结构，上调厚壁菌门的丰度，尤其是 Muribaculum sp002492595 物种，下调拟杆菌门的丰度，以及 Phocaeicola sartorii、Bacteroides thetaiotaomicron、Alistipes shahii、Duncaniella muris 和Intestinimonas timonensis.此外，发现粪便代谢物与肠道细菌之间存在密切关系。通过粪便代谢分析，确定了 60 个调控关键途径的生物标志物，包括嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢和嘌呤代谢。这些结果表明 PEP-1 作为天然抗炎多糖的潜力，其结构分析增强了对其特性的理解。我们的研究为使用 PEP-1 预防结肠炎症提供了科学依据，并为进一步探索潜在的抗炎多糖铺平了道路。
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