【写在前面】：本期推荐的是由广州中医药大学研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示 隐丹参酮通过 JAK2/STAT3 通路靶向 MDSCs 减轻子宫内膜异位症的免疫抑制作用。
【期刊简介】
【题目及作者信息】
Cryptotanshinone alleviates immunosuppression in endometriosis by targeting MDSCs through JAK2/STAT3 pathway
背景：子宫内膜异位症（EMS）是一种公认的慢性炎症性疾病，其特征是显著的免疫失调，其中骨髓源性抑制细胞（MDSCs）对于促进免疫抑制和推动疾病进展至关重要。隐丹参酮（CTS）是一种能够调节MDSC介导的免疫抑制的活性化合物；然而，其在EMS治疗中的疗效和机制尚不清楚。
目的：本研究旨在探究CTS通过JAK2/STAT3信号通路调节MDSCs的治疗潜力，并评估其对EMS中免疫微环境和内膜异位病变生长的影响。
方法：分析转录组数据（GSE141549）和单细胞RNA测序数据（GSE213216），比较EMS患者对照子宫内膜（CE）、正常位内膜（EuE）和异位内膜（EcE）中的免疫细胞群体。网络药理学分析、表面等离子共振（SPR）和细胞热位移分析（CETSA）被用来探索CTS对MDSCs作用的分子机制。建立C57BL/6J EMS小鼠模型，评估CTS对体内MDSC介导的免疫反应的影响。流式细胞术和免疫荧光用于分析免疫细胞群体，特别是MDSCs和CD8+ T细胞。制备体外骨髓（BM）源性MDSCs，以研究CTS对MDSCs频率和功能的调节活性。通过WB进一步检查CTS对JAK2/STAT3通路的影响。
结果：生物信息学分析显示，在三个进展阶段（CE、EuE和EcE）中，EcE阶段表现出相对较高的MDSCs水平和较低的CD8+ T细胞水平。网络药理学分析以及SPR和CETSA鉴定出CTS可能通过靶向JAK2/STAT3通路在EMS中调节MDSCs。体内研究表明，较高剂量的CTS治疗（60mg/kg）有效地抑制了病变生长，减少了MDSCs群体，并增强了CD8+ T细胞的浸润。体外实验显示，CTS以剂量依赖性方式降低了BM源性MDSCs的频率，并恢复了MDSCs对CD8+ T细胞的抑制能力。进一步的机制分析证实，CTS通过JAK2/STAT3通路调节与MDSCs相关的免疫抑制基因和蛋白的表达。
结论：本研究首次证明CTS是一种有前景的EMS治疗天然化合物，通过抑制MDSCs积累和调节MDSC介导的免疫反应。其治疗效果与调节JAK2/STAT3信号通路相关。
（图文摘要）
【前言】
子宫内膜异位症（EMS）是一种普遍的系统性疾病，其特征是生长在子宫外的血管化子宫内膜组织。最近的估计表明，全球大约有1.9亿例，即育龄妇女中有10%受到EMS的影响。尽管一些患者可能没有症状，但大多数EMS患者遭受痛经、持续性盆腔疼痛、不孕和自然流产的困扰，严重影响他们的生活质量。目前，治疗选择主要限于激素疗法，其中地诺孕素（DNG），一种人造孕激素，通常被用来抑制内膜异位病变的进展。然而，激素疗法仅仅管理疾病进展，并没有治愈病情，并可能导致严重的副作用。外科干预常常伴随着并发症和相当高的复发率，导致临床结果不满意。因此，研究更有效的EMS治疗选择是至关重要的。
骨髓源性抑制细胞（MDSCs）被定义为一群多样化的未成熟骨髓细胞，以其对各种免疫细胞的强大免疫抑制能力而闻名。在肿瘤中，MDSCs发展出通过产生免疫抑制分子（如精氨酸酶-1（Arg-1））来抑制T细胞反应的能力，创造了一个强烈抑制的环境，阻止了JAK2/STAT3激活在维持MDSC增殖和功能中的关键作用，通过调节STAT3来靶向MDSCs已被证明是EMS免疫疗法的有价值方法。
隐丹参酮（CTS）是一种从丹参中提取的脂溶性二萜化合物，这是一种传统中药，在亚洲国家已被广泛用于治疗月经失调、循环障碍相关疾病以及预防炎症数个世纪。一项荟萃分析显示，使用丹参的中药配方与促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）联合使用，可能会减少术后EMS复发和副作用，同时提高妊娠率。CTS显示出多种药理作用，包括抗肿瘤、抗炎、免疫调节、神经保护和抗纤维化特性。最近的一项研究表明，在肺鼠模型中以每天30和60毫克/千克的剂量给予CTS，可以减少肺部MDSC频率，减轻炎症，并降低STAT3磷酸化水平。然而，CTS是否能够调节MDSCs并调节EMS中的免疫抑制微环境仍然不确定。
在此，我们提出了EMS内膜异位病变中免疫抑制微环境的图谱，突出了MDSCs的增加和CD8+ T细胞的减少。我们还使用EMS小鼠模型来确定CTS对MDSCs驱动的CD8+ T细胞耗竭的抗免疫抑制效应和潜在机制。越来越多的证据表明，MDSCs在EMS患者的外周血、腹腔液和内膜异位组织中显著增加。此外，已确认EMS患者中效应免疫细胞介导的细胞毒性不足，这使得异位子宫内膜组织能够逃避免疫监视，促进内膜细胞增殖、血管生成、粘附和炎症，从而有助于内膜异位组织的发展和进展。先前的研究发现，从带有内膜植入物的小鼠中提取的MDSCs表达高水平的精氨酸酶和活性氧（ROS），这显著抑制T细胞增殖。支持这些发现的是，靶向MDSCs可能代表EMS的新治疗策略。
MDSCs通过多种因素显著扩增，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-6（IL-6）、乳酸和前列腺素，在微环境中与肿瘤发展、转移和免疫逃避密切相关。许多影响MDSCs的因素激活涉及Janus激酶（JAK）和信号转导及转录激活因子（STAT）蛋白的信号通路，这些通路对MDSCs的扩增和分化至关重要，特别是在肿瘤中。此外，GM-CSF/JAK2/STAT3轴促进MDSC的增殖，阻断这一通路可以恢复肝内抗肿瘤免疫。ROS介导的STAT3失活已被确定为减少肿瘤携带小鼠中MDSC浸润的关键机制。通过阻断MDSCs中STAT3的表达，miR-17-5p和miR-20a恢复了CD4+ T和CD8+ T细胞的细胞毒性。鉴于MDSCs的免疫抑制特性以及它们在EMS中的丰富性，以及CTS的潜在疗效。我们的发现扩展了对CTS免疫调节能力的理解，并揭示了其对EMS的潜在治疗益处，同时也为使用天然活性化合物靶向EMS中MDSC介导的免疫抑制提供了新的证据。
【结果】
1、在EMS中，MDSCs的百分比增加，CD8+ T细胞的百分比减少。
从NCBI的GEO数据库中获得了转录组数据（GSE141549）和单细胞RNA测序数据（GSE213216）。总共收集了198个EMS患者的异位内膜（EcE）样本和104个正常位内膜（EuE）样本，以及43个对照子宫内膜（CE）样本。使用ssGSEA算法比较GSE141549数据集中CE、EuE和EcE中的免疫细胞群体。箱线图显示了各种免疫细胞标记的标准化表达水平（图1A；补充表1）。在几种免疫细胞类型中观察到显著差异。值得注意的是，CD8+ T细胞从CE到EuE再到EcE显示出显著的下调趋势（p < 0.0001），而MDSCs显示出相反的趋势（p < 0.0001），表明与异位组织相关的免疫景观发生了变化。
然后我们应用了单细胞RNA测序数据集（GSE213216），并选择了16名EMS患者和2名非EMS患者进行进一步研究。总共收集了43个样本—34个EcE样本，7个EuE样本，和2个CE样本（补充表2）。数据经过UMAP分析。使用singleR函数，注释了8个细胞簇，包括间充质细胞（DCN, COL1A1, PDGFRA）、T/NKT细胞（CD3D, CD2）、内皮细胞（PECAM1, CD34, ESAM）、髓系细胞（LYZ, CD14, CLEC10A）、平滑肌细胞（ACTA2, MYH11）、B/浆细胞（JCHAIN, CD79A）、上皮细胞（KRT8, KRT19, EPCAM）和肥大细胞（TPSB2, KIT）（图1B和C）。然后我们根据已知的标记基因确定了四个髓系细胞簇，分别指定为巨噬细胞、树突状细胞、MDSCs和有丝分裂髓系细胞（图1D和E）。对于T/NKT细胞，揭示了四个不同的簇，包括CD8+细胞、CD4+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和未知T细胞（图1G, H）。簇的分数显示了髓系和T/NKT细胞群体的变化，特别是在EuE和EcE中MDSCs的显著增加，以及EcE中CD8+ T细胞的减少（图1F, I）。这些结果突出了EMS患者异位内膜中免疫细胞景观的显著变化，MDSCs上调和CD8+ T细胞下调，有助于理解EMS中的免疫失调。
2、CTS可能通过靶向JAK2/STAT3通路在EMS中调节MDSCs
CTS以其强大的免疫调节特性而闻名；然而，其对EMS背景下MDSCs的影响尚不清楚。为了研究这一点，我们利用网络药理学分析预测CTS可能通过哪些途径影响EMS中的MDSCs。我们首先从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得了2D分子结构（图2A），并通过TCMSP数据库获得了CTS的靶标。然后我们使用斯皮尔曼相关性分析（r>0.5, p < 0.05）在GSE141549数据集中识别与MDSCs正相关的基因。这些基因与已知的CTS药物靶标使用文氏图相交，得出了10个潜在靶标（图2B）。相交的基因被用来构建一个基于STRING数据库（https://string-db.org/）的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行可视化（图2C）。使用msigDB富集分析，识别了几个可能受CTS影响的途径（图2D）。值得注意的是，IL-6/JAK/STAT3信号通路被显著富集。此外，分子对接（图2E和F）显示CTS与JAK2的结合能为-9.048 kcal/mol，与Glu-898形成氢键，距离为3.5 Å，与STAT3的结合能为-7.856 kcal/mol，与Ser-85和Phe-93形成氢键，距离分别为3.3 Å和2.5 Å，表明CTS与JAK2和STAT3都有稳定且强烈的结合亲和力。补充的SPR实验证实了CTS与这两种重组人类蛋白之间存在直接的、正剂量依赖性的相互作用。STAT3的解离常数（Kd）为10.1 μmol/L（图2G），JAK2的为103 μmol/L（图2H）。作为进一步的结合确认，我们将BM源性MDSCs与CTS共孵化，并进行了CETSA测定。CETSA显示CTS热稳定了STAT3和JAK2（图2I和J），表明CTS与MDSCs中的STAT3和JAK2结合。因此，可以合理推测CTS可能通过JAK2/STAT3通路在EMS中调节MDSCs，但需要进一步的实验验证。
3、CTS在EMS小鼠中抑制内膜异位病变生长且无明显毒性
我们通过腹腔注射子宫碎片建立了EMS小鼠模型，以验证CTS对EMS发展体内抑制效果。小鼠口服给予载体、DNG（0.4 mg/kg）、CTS低剂量（20 mg/kg）或CTS高剂量（60 mg/kg），持续14天（图3A）。所有组小鼠的体重在EMS诱导后逐渐增加。然而，在实验开始前或结束时，各组之间的体重没有统计学上的显著差异。这表明CTS没有表现出任何明显的毒性（图3D）。在安乐死后，取出并检查了植入腹膜的内膜异位组织（图3B和C）。按照先前建立的建模方法（Luo等人，2020年），在所有小鼠中成功诱导了EMS，并通过组织学分析确认了内膜异位病变。平均病变体积分别为56.02 mm³（载体）、33.30 mm³（CTS低剂量）、19.50 mm³（CTS高剂量）和19.44 mm³（DNG）。与载体相比，CTS（低剂量和高剂量）和DNG治疗显著减少了病变体积（分别为p < 0.05和p < 0.01）（图3E）。平均病变重量分别为0.0416 g（载体）、0.0278 g（CTS低剂量）、0.0152 g（CTS高剂量）和0.0138 g（DNG）。与载体相比，CTS高剂量和DNG治疗组的病变重量显著减少（p < 0.01）（图3F）。载体组的H&E染色显示内膜异位病变内存在内膜上皮细胞和间质细胞，以及固有层的腺体增生。治疗后，特别是在CTS高剂量和DNG组中，观察到内膜厚度和腺体增生的减少（图3G）。
4、CTS降低MDSC频率并增强CD8+ T细胞在EMS小鼠中的浸润
我们的发现表明，CTS有效减少了EMS小鼠中内膜异位病变的生长并改善了组织病理特征（图3）。为了进一步了解这些效应背后的机制，我们研究了CTS对同一小鼠模型中免疫细胞群体的影响，特别是MDSCs和CD8+ T细胞。免疫荧光染色显示，与载体组相比，CTS高剂量和DNG治疗组中Gr-1（MDSCs的标记）阳性MDSCs的百分比显著降低（p < 0.01），而CTS低剂量组显示出下降趋势但没有统计学意义（图4A）。相比之下，CD8的染色显示，与载体组相比，CTS高剂量和DNG治疗组中CD8+ T细胞显著增加（p < 0.01）（图4B）。流式细胞术分析显示，载体组的脾MDSCs（CD11b+ Gr-1+）频率相对于对照组显著更高，并且在CTS和DNG治疗组中显著降低（图4C和F）。单核细胞髓系源性抑制细胞（M-MDSCs）（Ly6G- Ly6C+）和多形核髓系源性抑制细胞（PMN-MDSCs）（Ly6G+ Ly6C+）在载体组相对于对照组显著升高，而CTS（两种剂量）和DNG的治疗显著降低了这些MDSC亚型的频率（图4D, G和H）。此外，与对照组相比，载体组的CD8+ T细胞（CD3+ CD8+）比例显著降低，而CTS和DNG治疗组与载体组相比显著增加（图4E和I）。这些发现表明，CTS有效减少了免疫抑制性MDSCs的数量，同时增加了内膜异位病变和脾细胞中CD8+ T细胞的浸润和增殖，从而改善了EMS中的免疫反应。
5、CTS逆转MDSCs对CD8+ T细胞增殖的抑制作用
在BM细胞诱导成MDSCs期间添加CTS，并通过流式细胞术评估MDSCs的活性。尽管我们观察到随着CTS浓度的增加细胞活性略有下降，但在高达18 mg/L的浓度下CTS仍然安全可用于治疗（图5A）。为了进一步了解CTS对MDSCs频率和功能的影响，我们选择了1.5、3和6 mg/L的浓度。基于我们的综合网络药理学分析（图2），我们得出结论，CTS可能通过靶向JAK2/STAT3通路减轻MDSCs的免疫抑制效应。因此，我们选择了WP1066（5 μM），作为JAK2/STAT3抑制剂，作为阳性对照，以比较其与CTS的抑制效果。流式细胞术用于定量MDSCs及其主要亚型PMN-MDSCs和M-MDSCs的百分比。与新鲜分离的BM细胞相比，用GM-CSF和IL-6培养的BM细胞显示出MDSCs的频率显著更高，两种亚型都显著增加。CTS治疗显著降低了总MDSCs、M-MDSCs和PMN-MDSCs，与WP1066相似（图5B-D）。流式细胞术图（图5E和F）显示，CTS和WP1066减少了由GM-CSF和IL-6诱导的MDSC群体。这些发现表明，CTS可能有潜力减少MDSCs及其亚型，支持CTS可能影响免疫微环境的假设，并需要进一步研究。
基于上述证据，我们观察到体内CTS治疗后MDSCs和CD8+ T细胞的百分比发生变化（图4）。重要的是，作为免疫抑制细胞群体，MDSCs主要对T细胞，特别是细胞毒性CD8+ T细胞（Koh等人，2020年）发挥其免疫抑制效应。因此，我们假设CTS通过抑制MDSCs促进CD8+ T细胞浸润。为了验证这一假设，我们进行了BM源性MDSCs和T细胞的共培养实验。在用GM-CSF和IL-6体外刺激后，MDSCs被分别用载体或CTS处理。随后，它们与用CFSE标记并用CD3和CD28抗体刺激48小时的脾细胞共培养。流式细胞术分析显示，在用CTS处理的共培养系统中，无论是增殖的CD8+ T细胞数量还是CD8+ T细胞的比例都显著增加，且这种增加是剂量依赖性的（图5G和H）。
6、CTS通过JAK2/STAT3通路有效调节与MDSCs相关的免疫抑制基因和蛋白的表达
MDSCs的免疫调节功能依赖于多种功能分子，如Arg-1、IL-10、S100A8和S100A9。先前的研究表明，STAT3通过诱导S100A8和S100A9的表达来调节MDSCs的扩增。为了确认CTS是否通过JAK2/STAT3通路激活来抑制MDSCs的免疫抑制效应，我们进行了qPCR和西方印迹分析，以检查用CTS或JAK2/STAT3拮抗剂WP1066处理的BM源性MDSCs中Arg-1、IL-10、S100A8和S100A9的表达。根据qPCR分析，CTS显著且剂量依赖性地降低了这些基因的mRNA水平（图6A-D）。这些结果得到了西方印迹分析的支持，该分析揭示了CTS治疗降低了S100A8、S100A9、Arg-1和IL-10的蛋白水平（图6E, G-J）。WP1066同样降低了这些基因的表达，表明CTS通过JAK2/STAT3信号通路发挥作用，这对于MDSCs的扩增和免疫抑制功能至关重要。此外，西方印迹分析显示，用CTS和WP1066处理的体外BM源性MDSCs中JAK2和STAT3的磷酸化减少（图6F, K, 和L）。这些发现暗示CTS通过抑制JAK2/STAT3通路来降低重要的免疫抑制基因和蛋白的表达，进而影响MDSCs的免疫抑制活性。
EMS是一种与免疫功能障碍密切相关的慢性炎症性疾病，特别是当免疫监视未能有效清除异位子宫内膜细胞时。因此，免疫疗法已成为潜在的治疗策略，尽管当前的研究和临床应用仍然有限。CTS，一种主要从丹参中提取的生物活性成分，已显示出抗癌和抗炎特性。先前的研究表明CTS调节子宫内膜组织增殖和，表明其在治疗子宫内膜疾病的潜力。然而，其在EMS中的作用尚未被探索。本研究提供了CTS对MDSC的抗免疫抑制效应的首批证据，揭示了其激活JAK2/STAT3通路，抑制MDSC介导的免疫抑制，并减少EMS中内膜异位病变生长的机制。图7提供了CTS如何调节EMS中MDSC介导的免疫抑制的机制的图形说明。
根据形态学差异，MDSCs通常被明确为两个主要亚群：单核细胞MDSCs（M-MDSCs）和粒细胞MDSCs（G-MDSCs/PMN-MDSCs）。最近的一项研究通过门德尔随机化分析（一种使用遗传数据推断因果关系的统计方法）揭示了“Mo MDSC”升高与EMS风险增加之间的正相关。此外，许多研究发现，与非EMS个体相比，EMS患者中MDSCs显著增加，但这些研究中M-MDSCs的变化不一致。由于免疫抑制特性，MDSCs可以通过抑制CD8+ T细胞的增殖和激活导致免疫监视缺陷。多项证据表明，与非EMS女性相比，EMS女性腹腔CD8+ T细胞数量较少。然而，EMS中MDSCs与T细胞之间的联系尚未阐明。在本研究中，我们利用转录组和单细胞分析比较了健康对照和EMS患者中的正常位内膜以及EMS患者中的内膜异位病变的免疫微环境。值得注意的是，我们观察到内膜异位组织中MDSCs的数量显著增加，相应的活化CD8+ T细胞数量减少。我们的结果意味着MDSCs可能是随着疾病进展导致免疫监视丧失的原因，鉴于它们可能对CD8+ T细胞的抑制影响。
我们的网络药理学分析揭示了CTS可能通过多种途径调节EMS中的MDSCs，特别是免疫反应调节途径，如IL-6/JAK/STAT3途径、IFN-γ反应和TNFα/NF-κB信号通路，以及与糖酵解和缺氧相关的代谢途径。根据目前对MDSCs的理解，这些途径在调节它们的发展、招募和功能维持中起着关键作用。作为一种天然的抗炎剂，CTS已被证明可以抑制关键促炎细胞因子（如IL-6和TNFα）的释放，从而阻碍下游信号级联的激活。总体而言，CTS似乎通过上述途径对MDSCs发挥调节作用。然而，鉴于IL-6/JAK/STAT3途径在我们的富集分析中的排名最高，我们优先对这一特定途径进行了深入的机制研究。分子对接、SPR和CETSA实验的结果证实了CTS对STAT3和JAK2的靶向效应。实际上，CTS已被证明通过抑制STAT3的Src Homology 2结构域含磷酸酶2（SHP-2）活性，从而增加STAT3的去磷酸化并抑制其激活。JAK2磷酸化的抑制被认为是CTS治疗的次要结果。CTS已被证明通过降低JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，以时间和剂量依赖性的方式阻碍Hepa1-6细胞的扩增。同样，Man等人报告说，CTS不仅抑制肺癌细胞的生长，还通过JAK2/STAT4途径增强抗肿瘤免疫，增强CD4+ T细胞的细胞毒性。这些发现表明，CTS作为一种天然的STAT3抑制剂，可能调节免疫抑制性肿瘤微环境，从而表现出抗肿瘤活性。
EMS具有几种类似癌症的特征，包括增加的侵袭性和粘附性、抗凋亡、免疫功能障碍和代谢重编程。这些生存机制使内膜异位病变能够植入、生长和侵入周围组织。在这种情况下，较高剂量的CTS（60 mg/kg）被发现显著减少EMS小鼠模型中内膜异位组织的生长，其抑制效果与DNG（临床上用于EMS管理的一线孕激素）相当。这与DNG对EMS病变的抗增殖和抗凋亡作用一致。进一步的研究表明，CTS高剂量治疗在体内显著增强CD8+ T细胞浸润，同时减少MDSCs的比例，包括PMN-MDSCs和M-MDSCs。与我们的结果一致，以前的研究报告称，在内膜移植的小鼠中，腹腔细胞中两个主要MDSC亚群的比例随时间增加。此外，通过用抗Gr-1单克隆抗体耗尽MDSCs，显著抑制了EMS小鼠中内膜异位植入的生长，而移植外源性MDSCs可以逆转抑制效应（Zhang等人，2018年）。综合这些发现，我们提出CTS可能通过抑制MDSC介导的免疫抑制来减轻EMS中内膜异位病变的植入和生长。
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