【写在前面】：本期推荐的是由华中科技大学同济医学院研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示大承气汤通过维持肠道血管屏障的完整性，改善了肝纤维化小鼠的肝损伤。
【期刊简介】
【题目及作者信息】
Dachengqi decoction ameliorated liver injury in liver fibrosis mice by maintaining gut vascular barrier integrity
（图文摘要）
【前言】
肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理过程，也是决定肝脏相关死亡率的最重要因素。它分为四个阶段，其中3级和4级纤维化被归类为肝硬化。了解肝纤维化的发病机制将有助于有效预防和治疗疾病，减少国家经济和健康负担。肠道-血管屏障（GVB）是肠道物理屏障的最后一道防线，对保护身体至关重要。GVB主要由血管内皮细胞组成，它们与周细胞和肠胶质细胞一起，形成减少紧密连接处的细胞间分子运输的结构单元，并维持屏障完整性。在健康状态下，GVB阻止细菌及其代谢产物从肠腔进入循环系统。当GVB受损时，病原体通过门静脉到达肝脏，影响肝病的发生和发展。因此，阐明肝纤维化中GVB破坏的机制，有助于从肠肝轴的角度探索治疗肝硬化的新方法。
大承气汤（DCQD）是《伤寒论》中的经典方剂，由大黄、厚朴、枳实和芒硝组成。它在临床实践中被广泛用于缓解腹痛和急性胰腺炎。DCQD已改善肠道粘膜屏障功能，并减少肠道炎症反应。然而，DCQD对肝纤维化的影响尚不清楚。
本研究表明，CCL4诱导的肝纤维化小鼠存在GVB损伤，这通过肠肝轴的相互作用加剧了肝炎症。 DCQD通过这种双向交流部分恢复了GVB的完整性，这上调了肠道中的FUT2/Wnt/β-Catenin通路，并下调了肝脏中的ESR1/NF-κB/TNFα通路，从而抑制了“肝-肠-肝”闭环损伤和炎症。
【结果部分】
1、肝纤维化小鼠的肠道屏障损伤是通过肠肝轴发生的
为了明确肝纤维化小鼠是否存在肠道屏障损伤，我们对CCL4诱导的小鼠的肝脏组织和远端回肠组织进行了生化分析。CCL4诱导的小鼠肝脏显示出明显的纤维化特征，如肝小叶结构的紊乱、炎症的浸润、斑点状和灶性坏死、细胞质空泡化以及胶原纤维的增殖，同时转氨酶和肝脏指数显著增加（图1A，1I-L）。这些结果表明，通过每周两次CCL4处理诱导的纤维化小鼠模型是成功的，适合进行后续研究。考虑到肝脏和肠道之间的相互作用，我们试图澄清肝纤维化是否影响肠道屏障。在CCL4诱导的小鼠中，与肠道屏障相关的分子如Tjp1（ZO-1）、Ocln和Cldn1的表达被下调，肠道渗漏以FITC-Dextran-70 kDa（FD70）为标志在肝脏和脾脏中增加，粪便中的短链脂肪酸（SCFAs）含量减少（图1B，D-F）。此外，肠道血管屏障（GVB）损伤标志物PV-1（Plvap）和产生一氧化氮的Nos2在CCL4诱导的小鼠中增加（图1C，E），表明肠道血管屏障受损。CCL4诱导的小鼠血清内毒素水平升高与它们肝脏中细菌易位的增加一致（图1G-H），这表明CCL4介导的肠道屏障损伤促进了细菌通过肠肝轴进入肝脏。
2、大承气汤（DCQD）改善了CCL4诱导的小鼠肝损伤
研究已经证实了DCQD在调节免疫反应、减轻炎症反应和维持肠道动力方面的作用，但DCQD是否在肝纤维化及其相应的肠道屏障损伤中发挥作用尚不清楚。因此，我们通过胃管给CCL4诱导的小鼠给予DCQD，并使用乳果糖作为阳性对照。原因如下：（i）作为一种渗透性泻药，乳果糖具有与中药复合物DCQD相似的通便和清浊效果。（ii）作为一种益生元，乳果糖可以增加有益细菌和SCFAs，并维持肠道微生态平衡，类似于富含蒽醌的DCQD的抗菌效果（Bloom和Tapper，2023年）。DCQD的质谱分析如图2I所示。根据我们的结果，DCQD有助于维持肝小叶的正常结构，减少炎症细胞浸润，减少肌成纤维细胞激活，抑制胶原纤维增殖，降低血清转氨酶水平和肝脏指数，并改善CCL4介导的小鼠体重下降（图2A-G）。此外，DCQD降低了肌成纤维细胞标志物（Vimentin）的mRNA表达，细胞外基质成分（Col4a1）和促纤维化因子（Ctgf）（图2H）。因此，我们的结果表明，DCQD以剂量依赖性方式改善了CCL4诱导的小鼠肝损伤，而乳果糖几乎没有效果。
3、大承气汤（DCQD）改善了CCL4诱导的小鼠的肠道炎症和肠道血管屏障功能障碍
作为半透性屏障，肠道血管屏障（GVB）只允许小于4 kDa的分子通过，因此我们将FD70注射到小鼠回肠末端的肠环中，以研究DCQD在肠道屏障中的作用。观察到FD70在CCL4诱导的小鼠的肝脏和脾脏中增加，而DCQD减少了FD70的渗漏（图3A-B）。值得注意的是，肝脏中的FD70点高于脾脏中的点，这与FD70从受损的肠道屏障漏入肠血管系统并通过肠系膜-门静脉系统进入肝脏一致。缩短结肠广泛用于评估肠道炎症，但在此实验中未观察到显著的结肠缩短（图3C）。在CCL4诱导的小鼠中，肠道屏障分子和粪便SCFA水平降低，而炎症因子和PV-1（Plvap）上调（图3D-H）。此外，DCQD抑制了CCL4诱导的小鼠外周循环中的内毒素水平升高和肝脏中的细菌易位，而这些并未通过乳果糖得到改善（图3I-J）。因此，我们的结果显示，通过胃管给予DCQD部分改善了CCL4诱导的小鼠的肠道屏障损伤、炎症浸润和细菌易位，呈现剂量依赖性，但乳果糖干预没有显著效果。
4、大承气汤通过ESR1/NF-κB/TNFα通路改善肝组织损伤和炎症浸润
为了阐明DCQD在CCL诱导的肝纤维化中的分子机制，我们基于DCQD成分和肝硬化进行了网络药理学分析。获得了151个DCQD-肝硬化交叉基因，其中TNF位于交互网络的中心区域；以TNF为中心的网络与大多数中心基因如ESR1、INS、JUN、NOS3、PTGS2、MAPK1、NR3C1、TH、CAT、F2、PRKCA、CNR1有很好的关联（图4A-C）。相应地，TNF在CCL4诱导的小鼠回肠中上调，并且在DCQD干预后降低（图3F），促使我们关注TNF，这是一个参与炎症、细胞死亡和免疫反应的分子。进一步的富集显示ESR1是DCQD干预肝纤维化的重要调节因子，在KEGG和GO中富集（图4D-E）。据报道，ESR1与NF-κB受体激活信号的血浆标志物正相关（Mintz等人，2022年），并且NF-κB/TNFα通路被证明促进肝纤维化进展（Zhang等人，2019年）。研究表明，ESR1通过肠杆菌参与草药抗肝硬化（Zhou等人，2023年）。转录因子数据库的筛选结果表明ESR1调节NF-κB和TNFα的表达（补充图1）。因此，我们使用了表现出最显著趋势的高剂量组来检测上述靶标，结果证明DCQD下调了ESR1、NF-κB和TNFα（补充图2）。
5、DCQD减少了CCL4诱导的小鼠肠道中炎症细胞的募集
接下来，我们研究了肝脏病理变化和炎症反应如何破坏肠道血管屏障（GVB）。流式细胞仪结果显示，从CCL4诱导的小鼠小肠固有层分离出的炎症单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的百分比增加（图5A-C），这与CCL4诱导的小鼠中加剧的炎症一致，表明由肝脏刺激引起的全身炎症反应促进了CCL诱导的小鼠肠道中炎症免疫细胞的募集。DCQD减轻了这些浸润（图5A-C）。对肠道屏障的刺激允许内毒素通过门静脉传播，细菌易位到肝脏（图1G-H，3I-J），加剧了肝脏炎症和纤维化，形成了肠肝相互作用损伤的闭环。此外，西方印迹证实DCQD上调了紧密连接蛋白Occludin（Ocln），下调了GVB损伤标志物PV-1，有助于DCQD处理的小鼠恢复到接近正常对照组的状态（图5D-E）。因此，DCQD由于肠肝轴的内在相互作用，对肝脏和肠道发挥了保护作用。DCQD通过在CCL4诱导的小鼠中上调FUT2缓解了GVB损伤。
6、DCQD对小鼠肠道菌群的影响
为了阐明DCQD改善GVB损伤的机制，我们对远端回肠进行了RNA测序。主成分分析（PCA）显示CCL4和对照组分为两个簇，DCQD组与对照组相似，表明DCQD干预倾向于使CCL4小鼠正常化（图6A-B）。对照组和CCL4组之间有1640个差异表达基因（DEGs），其中712个上调，928个下调（图6G）。Wnt/β-Catenin通路，一个公认的调节GVB的信号轴，其激活有助于GVB稳态，相关基因也包含在这些DEGs中。例如，在CCL4诱导的小鼠中，Wnt10b、Wnt11和Wnt2b下调，而Wif1（Wnt通路的抑制因子）上调，维持GVB稳态的基因（Apc、Dvl3、Tgfb1）下调，与肠道屏障损伤相关的基因（Mmp7、Mmp9）上调（图6H）。CCL4诱导的小鼠中β-Catenin的下调被DCQD恢复（图6I）。CCL4和DCQD高剂量组的DEGs的GO和KEGG富集表明，核糖体通路在两种富集方法中排名都很高（图6C-D），表明DCQD可能通过调节关键分子的蛋白质合成来保护CCL4诱导的小鼠的肠道屏障（图6E）。RNA测序和西方印迹显示CCL4组中Fut2下调，这被DCQD逆转（图6F，I）。岩藻糖基转移酶2（Fut2），主要在肠道上皮细胞中表达的FUTs亚型，是维持肠道屏障稳态和抑制肠道炎症反应的关键。因此，基于肠肝轴的相互作用，DCQD通过在CCL4诱导的小鼠中上调FUT2缓解了GVB损伤。
失代偿期肝硬化是慢性肝病的晚期阶段，肠道细菌易位是失代偿期患者发生内毒素血症和自发性细菌性腹膜炎的关键。因此，保护肠道屏障是肝硬化治疗中不可或缺的治疗策略。中医经典理论中的“肝肠相通”指出肝硬化的病理机制是肝脏失去解毒和排泄废物的能力，导致肠道中毒素的滞留。中药复方大承气汤（DCQD）适用于治疗这种病理机制。尽管临床研究已经证实DCQD在术后恢复胃肠动力方面的有效性，但DCQD在肝纤维化患者中的作用尚不清楚。我们的结果表明，DCQD有助于抑制CCL4诱导的小鼠肝纤维化的进展，并减轻GVB损伤，这是通过肠肝轴介导的（图7）。
“肝到肠”的胆道系统和“肠到肝”的门静脉循环使肠肝轴成为一个生理闭合回路。在病理条件下，起源于肝脏的损伤通过营养物质、胆汁酸和免疫介质传递到肠道，刺激肠道炎症反应和介导肠道屏障损伤；肠道屏障功能障碍促进细菌易位和感染，加剧肝病的进展。例如，在酒精性肝病中，有益细菌A. muciniphila的丰度减少或有害细菌E. faecalis的增加，这促使由肠道内毒素或细菌素介导的促炎细胞因子的释放，导致肠道粘膜和肝脏的损伤。在肝硬化阶段，更严重的胃肠道屏障损伤和由肠道菌群失调介导的细菌易位，加上由内毒素和其他病原体相关分子模式介导的系统性炎症，进一步支持了肠肝轴在推动疾病进展中的作用。在我们的研究中，CCL4诱导的小鼠显示出肠道屏障损伤和肠道渗漏特征，内毒素水平升高，细菌易位到肝脏，炎症介质激活，反映了肠肝轴的闭合回路损伤。令人鼓舞的是，DCQD的口服给药部分逆转了这些损伤。
DCQD通过恢复小鼠肠道中的SCFAs下调ESR1/NF-κB/TNFα，以抑制CCL4诱导的肝脏炎症反应。除了器官间的闭合回路损伤外，由微生物代谢产物产生的SCFAs等保护性介质通过肠轴传递到远端器官以发挥其作用。研究表明SCFAs通过G蛋白偶联受体或组蛋白去乙酰化酶调节免疫反应和细胞代谢，以维持肠道稳态；SCFAs改善了脂肪肝小鼠的脂肪肝和肝脏炎症。我们的结果中DCQD恢复了粪便中SCFAs的水平。报道称SCFAs抑制了ESR1、NF-κB和TNFα的活性，其中NF-κB/TNFα通路被证明促进了肝硬化的进展。基于DCQD-肝硬化网络药理学分析，ESR1参与了KEGG和GO富集的多条途径，表明ESR1是DCQD缓解纤维化表型的关键靶点。此外，ESR1在所有四种性别无关的肝纤维化基因敲除小鼠模型中均呈正富集，这与我们在CCL4诱导的TNFα组中发现的ESR1上调一致。进一步分析确定了TNFα作为与ESR1蛋白-蛋白相互作用的TOP级目标分子。一致地，有ChIP-seq证据表明ESR1作为转录因子调节NF-κB和TNFα。因此，作为ESR1下游靶标的NF-κB/TNFα，在DCQD缓解的肝纤维化中发挥了关键作用。
DCQD抑制免疫细胞介导的炎症，并上调fut2和Wnt/β-catenin以减轻CCL4诱导的小鼠GVB损伤。肠道髓样细胞及其促炎细胞因子在肠道屏障损伤中很重要。据报道，在右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠中，巨噬细胞和中性粒细胞显著增加，促进了炎症性癌症转化的发生；丁酸，一种短链脂肪酸，限制了与中性粒细胞相关的免疫反应和中性粒细胞胞外陷阱的形成，改善了肠道粘膜炎症。正如我们的结果所示，肠道髓样细胞被募集到CCL4诱导的小鼠的肠道固有层，表明对肠道屏障的损伤反应，DCQD将减轻这种反应。RNA测序和蛋白印迹的结果证实DCQD通过调节核糖体通路上调了回肠中的FUT2，从而驱动Wnt/β-Catenin的激活，维持肠道血管屏障的完整性。据报道FUT2有助于维持肠道屏障的完整性。肠道共生细菌迁移到深层隐窝，促进FUT2+潘氏细胞与α-防御素颗粒的分化，加强肠道防御系统的建立；在DSS诱导的结肠炎中，FUT2促进了肠道干细胞的生存和自我更新，增强了肠道对压力和炎症刺激的抵抗力。此外，Wnt/β-Catenin通路的下调表明GVB受损，DCQD对此进行了重塑。
中医药及其有效成分在与肠肝轴相关的疾病的临床前研究中的应用显示出其良好的治疗潜力。例如，王氏保赤丸通过恢复肠道机械屏障、调节肠道菌群和减少炎症反应，减轻了肠易激综合征小鼠的胃肠道状况；葡聚糖硫酸钠通过增加Akkermansia muciniphila改善了脂肪肝小鼠的葡萄糖代谢和肠道屏障功能障碍；表没食子儿茶素没食子酸酯通过影响肠道微生态改善了小鼠的脂肪肝肝炎。基于肝纤维化的中医理论，我们创新性地提出了科学假设，即临床上用于治疗急性胰腺炎的处方DCQD可能缓解肝纤维化。进一步的网络药理学和RNA测序方法揭示了DCQD打破了肠肝轴的闭合回路损伤，通过调节FUT2维持肠道血管屏障的完整性，并通过调节ESR1/NF-κB/TNFα通路，减轻了SCFAs的全身炎症反应。
尽管缺乏文献支持DCQD在结肠炎临床前研究中的应用，但据报道DCQD中含有的化合物对DSS诱导的小鼠结肠炎有效，暗示富含多种化合物的DCQD具有更广泛的治疗效果。橙皮素通过阻断RIPK3/MLKL坏死信号通路维持上皮屏障，改善了DSS诱导的结肠炎；大黄素和黄芩素的组合协同对抗DSS诱导的结肠炎，通过减少CD14/TLR4/NF-κB通路。
该研究在几个方面受到限制。尽管我们已经富集并验证了DCQD在肝脏和肠道中的信号通路，但我们缺乏相应的转基因小鼠进行挽救验证。在无菌小鼠中进行粪便微生物群移植实验将更有说服力地证明肠道屏障破坏导致肝脏损伤和肠肝轴之间的卵形交流。此外，缺乏高质量的多中心临床应用DCQD的结果，进一步支持我们的研究。
【结论】
总之，我们的结果表明DCQD抑制了CCL4诱导的小鼠肝纤维化的进展，并减轻了肠道血管屏障损伤，这是通过在多器官、多靶点水平上调节肝脏中的ESR1/NF-κB/TNFα通路和回肠中的FUT2/Wnt/β-Catenin通路，阻断肠肝轴的闭合回路损伤刺激来实现的。
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