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实验前一天晚上将成年斑马鱼按照雌雄比1：1放入产卵器中，使用透明隔板将雌鱼及雄鱼分隔开，第二天待产卵后，挑选优质胚胎孵育至6hpf后进行暴露实验。设置对照组(CTR0.01%丙酮)和BPS(8.13mg/L)，BPF(2.08mg/L)和MIX(4.38mg/L)等三个处理组，加入预先配制BPS，BPF溶液进行暴露。每间隔24h换液一次以
保持染毒浓度
斑马鱼的侧线系统是起源于皮肤的感觉器官，它由神经肥大毛细胞与侧线神经丘组成，毛细胞的缺失以及侧线神经丘的损伤可能导致听力受损或前庭疾病。因此，通过可视化神经丘结构和毛细胞来评估侧线系统的发展，采用扫描电镜观察不同治疗组侧线神经丘的发育情况。在离心管中收集暴露于5dpf的胚胎,每组20个胚胎。每管加入1mLPBS经过3次反复漂洗，每次1min，吸去残液后加入2.5%戊二醛固定一晚，第二天使用乙醇梯度脱水三次，将斑马鱼置入干燥机干燥，最后将脱水和充分干燥的斑马鱼样品放置在载体台上，使用扫描电子显微镜观察侧线神经丘毛细胞。侧线神经丘能够协助斑马鱼感知周围水流变化，与神经系统密切相关。
斑马鱼行为评估
自主运动：
将暴露后120hpf的斑马鱼幼鱼转移至96孔无菌培养板里面，随后利用动物行为观察分析系统进行行为测试。使用软件进行运动轨迹视频采集，统计20min内幼鱼的移动距离及速率作为自主运动活力的评价指标。
120hpf斑马鱼自主运动轨迹
正常情况下斑马鱼幼鱼在空旷条件下一般很少表现出大幅度转向，且在较暗环境下幼鱼的转向活动更为频繁，BPS和BPF处理组幼鱼在黑暗阶段进行的10°-90°的转角次数较对照增多，而BPF暴露组出甚至出现个别斑马鱼转角大于90°的现象，表明BPF组的幼鱼内心出现明显的焦虑。
光暗节律：
设置光暗周期为光照:黑暗=5min:5min，并循环3次，光照黑暗条件均设置为100%。在5min黑暗环境适应期后，运用软件进行运动视频采集并计算运动速率，检测光照刺激与黑暗条件下下幼鱼的运动状态。
BPS和BPF均对斑马鱼的运动行为以及精神状态产生影响，这种影响主要包括移动距离和速度的降低，对于光暗感官功能失调以及焦虑不安。
心跳频率：
检测斑马鱼72hpf的心跳频率，BPF暴露会使得斑马鱼心跳频率显著增强，而同等效应的混合物暴露仅轻微加快斑马鱼心跳。
表观形态：
对不同暴露时间的斑马鱼进行表观形态，并对体长，游泳囊，卵黄囊和心包等表观特征进行测量。
血管损伤：
暴露组斑马鱼血管出现不同程度的损伤，BPS和BPF暴露后，斑马鱼头部出现血管分支杂乱，排列不齐，BPS暴露后心脏血管出现轻微消融现象，在BPF及混合物暴露组当中甚至观察到斑马鱼眼球血管结构损伤。BPS和BPF的暴露使得斑马鱼主血管和尾静脉血管也会出现轻度损伤。对尾静脉血管宽度的量化，BPS和BPF暴露组斑马鱼尾静脉的宽度缩短。
120hpfTg(kdrl：EGFP)斑马鱼血管形态观察
黄色和绿色箭头分别标记了斑马鱼头部的眼球、脑颅内血管紊乱。
参考文献：
杨潇,包志伟,韩晓雯,等。亚致死剂量等效应浓度双酚S和双酚F的毒性差异和联合作用分析-以斑马鱼幼鱼表型、行为、血管和神经为例[J/OL].中国环境科学,1-10[2024-11-12].
Darvishi M, Safari R, Hoseinifar S H, et al. Sublethal doses of diazinon affected reproductive, immune, and oxidative status in female zebrafish (Danio rerio) [J]. Aquaculture Reports, 2022, 22: 100944.
Hardy K, Amariutei A E, De Faveri F, et al. Functional development and regeneration of hair cells in the zebrafish lateral line [J]. The Journal of physiology, 2021, 599(16): 3913-36.
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