调节性 T 细胞（Treg）在预防自身免疫、维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受性中发挥着重要作用，利用 Treg 的抑制活性进行临床治疗也是一个主要的研究领域。其在治疗自身免疫性疾病、预防移植排斥、癌症免疫治疗、过敏反应以及应对传染病方面具有巨大的潜力。
不过 Treg 细胞虽然热门，但细胞分选还是有点难做的！这不，师姐做完 Treg 细胞的体外功能实验，课题就差临门一脚时，意外发生了……
师姐
真是水逆，实验数据一直不稳定。一时不知是分选的 Treg 细胞活性不好？纯度不够？还是存在其他因素干扰？怎么办啊？
别纠结那么多了。我看隔壁组有人用CD4+CD304+ 磁珠分选，效果不错，还可解离磁珠，无需耗时的清洗步骤，你可以试试。
师兄
听了师兄的推荐，是否有所动心？免费试用的机会来啦！STEMCELL 研发并推出了以CD304 为靶向标志物的分选试剂盒EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 调节性 T 细胞分选试剂盒（产品号 #100-1570，点此可免费申请试用），其可简单、快速地从小鼠脾细胞或淋巴结中分离出 CD4+CD304+（胸腺来源或天然）调节性 T 细胞，只需 45 分钟，纯度达 94%，并且还可从同一样本中分离出 CD4+CD304- 应答 T 细胞以进行功能分析（如 Treg 抑制分析）。
接下来，让我们一起深入了解 Treg，全面掌握其免疫抑制机制、标志物以及分选注意事项！
知己知彼：Treg 的那些事
01
Treg 的免疫抑制
Treg 可通过多种免疫抑制机制来维持免疫耐受，防止免疫系统攻击自身组织：
通过高亲和力 IL-2R（CD25）清除 IL-2：IL-2 是 T 细胞增殖和激活所必需的细胞因子，Treg 细胞高表达 CD25，即 IL-2 受体的 α 链，从而使其能够结合并清除 IL-2 并有效地抑制 T 细胞的扩增和活性。
分泌抗炎细胞因子：Treg 可分泌抗炎细胞因子，如 IL-10、TGF-β 和 IL-35，这些细胞因子能够抑制炎症反应，减轻免疫反应强度。
通过穿孔素 / 颗粒酶杀死自身反应性细胞：Treg 细胞可以通过细胞毒性机制直接杀死自身反应性细胞（靶向自身抗原的细胞）。
CTLA-4 抑制性受体阻断 CD28 激活：CTLA-4 是 Treg 细胞表达的抑制性受体，其与 CD28（T 细胞激活所需的共刺激受体）结合相同的配体，可阻断 T 细胞激活所需的共刺激信号，从而有效地抑制免疫反应。
PD-1 抑制自身反应性 B 细胞：PD-1 是 Treg 细胞表达的另一个抑制性受体，其可以抑制 T 细胞，且在抑制自身反应性 B 细胞中发挥作用。通过与 B 细胞上的配体 PD-L1 相互作用，PD-1 可以抑制 B 细胞激活和抗体产生。
细胞外腺苷介导的免疫抑制：Treg 细胞表达 CD39 和 CD73 等酶，这些酶将 ATP 转化为腺苷。腺苷是一种免疫抑制分子，可以抑制 T 细胞激活并促进 Treg 细胞功能。
图 1 Treg 介导的免疫抑制机制
02
Treg 的标志物
目前仍未发现有唯一的细胞表面标志物可以特定识别 Treg。随着研究发现细胞内转录因子 FOXP3 是主要控制 Treg 发育和功能的关键基因，目前Treg 的「标准」表型被确定为 CD4+CD25+FOXP3+。
Treg 的亚群Treg 可分为两种主要的亚群：
胸腺来源（或天然）Treg：这些 Treg 细胞在胸腺中发育，并从两个不同的 CD4 单阳性祖细胞亚群（CD25+FOXP3- 或 CD25-FOXP3low）分化而来，天然 Treg 细胞被认为是中央耐受的主要介导者，防止自身反应性 T 细胞在胸腺中发育。
外周来源（或诱导）Treg：这些 Treg 细胞在外周淋巴组织中产生（例如淋巴结和脾脏），在外周抗原刺激 naïve T 细胞后诱导产生。诱导性 Treg 细胞在外周耐受中起着至关重要的作用，可抑制对外来抗原的免疫反应，并防止外周的自身免疫反应。
小鼠 Treg 通常以 CD4+CD25+ 作为表型。此外，CD4+CD45RBlow 细胞群是另一类小鼠 Treg，在维持免疫稳态和抑制自身免疫反应中发挥着关键作用。对人 Treg 而言，大多数以 CD4、CD25 和转录因子 FOXP3 作为标志物。CD127 是 IL-7 受体，其在成熟 T 细胞上表达，对增殖和分化具有十分重要的作用。然而，CD127 在人 Treg 中的表达较低或不表达，且与 FOXP3 水平呈负相关。因此，CD127 可作为人 Treg 特征标志物与活化的 T 细胞进行区分。
神经纤毛蛋白 - 1（Nrp-1 或 CD304）的表达与 CD25 密切相关，并且可以区分小鼠胸腺来源（天然）Treg 和诱导性 Treg。天然 Treg（nTregs）通常高表达 CD304，而诱导性 Treg（iTregs）通常低表达或不表达 CD304。此外，CD304 在增强 Treg 与树突状细胞（DCs）的相互作用中起着至关重要的作用，其可与 DCs 上的 Sema4A 结合，稳定 Treg 与 DCs 的相互作用。
03
Treg 的分选
在进行 Treg 分选时，通常以 CD4 和 CD25 作为标志物，其充分利用 Treg 上 CD25 的高表达来富集 FOXP3+ 细胞。然而靶向 CD25 可能会干扰 Treg 中的 IL-2 信号传导，影响下游的功能实验。因此，分选时以 CD304 为靶向标志物，而非 CD25（IL2RA），可避免对Treg 中 IL-2 信号传导的干扰，从而能够确保维持 Treg 的功能。
EasySep™ Treg 试剂盒首先通过正选 CD304+ 细胞，然后在一个步骤中同时去除磁珠和非 CD4+ 细胞，最终分选后的细胞中含有高表达 FOXP3 和 CD25 的 CD4+CD304+ 细胞，并且不含磁珠，可立即用于下游应用，如流式细胞术、细胞培养或 DNA/RNA 提取等。
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产品优势：
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● 使用 EasySep™ Release RapidSpheres™ 可解离磁珠，无需耗时的清洗步骤；
● 可从同一供体中分离出 CD4+CD304- 应答 T 细胞。
产品数据：
图 2 使用 EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 调节性 T 细胞分选试剂盒分离无磁珠标记的小鼠 CD4+CD304+ 天然调节性 T 细胞和应答 T 细胞的操作流程
图 3 EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 调节性 T 细胞分选试剂盒可分离出高纯度的 CD4+CD304+ 细胞，这些细胞可高表达 Treg 标志物 FOXP3 和 CD25
（A）起始样本为 naïve 小鼠脾细胞，分选后的 CD4+CD304+ T 细胞通常为 90.4 ± 3.0%，CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 细胞为 71.0 ± 4.6%（平均值 ± 标准差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁极）。在上述示例中，起始样本和最终分选后的 CD4+CD304+ 细胞纯度分别为 3.0% 和 90.2%；CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 细胞为 1.9% 和 73.0%。
（B）起始样本为 naïve 小鼠淋巴结，分选后的 CD4+CD304+ T 细胞通常为 92.1 ± 0.7%，CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 细胞为 78.1 ± 1.4%（平均值 ± 标准差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁极）。在上述示例中，CD4+CD304+ 细胞的起始和最终分选后的纯度分别为 5.4% 和 92.3%；CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 细胞分别为 4.0% 和 77.1%。
（C）起始样本为 naïve 小鼠脾细胞，分选后的 CD4+CD304- 应答 T 细胞通常为 94.1 ± 2.9%，CD4+CD304-CD25-FOXP3- 细胞为 90.6 ± 3.0%（平均值 ± 标准差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁极）。
在上述示例中，CD4+CD304- 细胞的起始和最终分选后的纯度分别为 11.9% 和 95.4%；CD4+CD304-CD25-FOXP3- 细胞分别为 11.4% 和 94.4%。
内容策划：沈佳钰
内容审核：吴军
文中图片来源：STEMCELL
题图来源：自制