文 | 清墨史纪
编辑 | 清墨史纪
<<——【·前言·】——>>
胡桃，又名波斯核桃，属于胡桃科，原产于东南欧、西亚和中国西南部，由于其坚固的木材和营养丰富的坚果，这种植物物种广泛分布在世界各地，除了南极洲。
近年来，随着改良品种的发展，优良品种的幼苗越来越受到农民的欢迎。然而，传统的低效率嫁接育苗方法极大地限制了优良品种的繁殖和推广。
近年来，组织培养已成为快速育苗和提高生产效率的有效方法，外植体褐变是限制核桃组织培养的关键因素之一。
已经使用了多种方法来减少核桃外植体组织褐变的发生，但效果并不理想。
一、酶与植物褐变的关系
酶促褐变是植物组织培养中外植体褐变的主要原因，一般来说，多酚氧化酶和过氧化物酶是导致这种褐变的主要酶。
当外植体被切割时，细胞受损，酚类被酶释放并氧化成醌，从而导致酶促褐变。此外，酶促反应形成的醌可与蛋白质形成交联。
也可通过脱水和聚合等一系列复杂的生化反应在组织中聚合，生成深色黑色素化合物，破坏组织代谢，抑制生长，最终导致外植体褐变和死亡。
PPO是导致酚类化合物氧化的主要酶，酚类化合物被PPO氧化成醌衍生物，并进一步氧化形成色素黑色素，黑色素存在于生物体中，负责褐变反应。
PPO是一组含铜酶，在氧气存在下可催化单酚的O-羟基化为邻二酚以及邻二酚氧化为醌。PPO在动物中有几个明确的作用，包括皮肤/外骨骼色素沉着和角质层硬化。
与动物和真菌PPO不同，许多植物PPO缺乏单酚氧化酶活性。然而，PPO在核桃中显示出相当高的单酚酶活性。
在体内，PPO活性通常与衰老、受伤或受损的植物组织有关，其中细胞区室化丧失，然而，PPO在植物中的生理作用尚不清楚。
大多数相关植物研究主要集中在PPO在采后褐变中的作用，其中切割或受损的植物组织由于PPO生成的醌的聚合而变成棕色，从而产生植物黑色素化合物。
二、PPO转录在外植体褐变和存活中的作用
核桃枝和叶富含酚类物质，这导致在培养过程中这些组织外植体产生的褐变敏感性增加。在过去的几十年里，外植体褐变一直是与核桃组织培养相关的难题。
PPO转录和活性在外植体褐变和存活中起关键作用。Shi报道，核桃接穗的存活率与嫁接过程中酚含量和PPO活性密切相关。
Araji等人得出结论，PPO在继发代谢中起着新颖的基本作用，并作为王猪病细胞死亡的间接调节因子。
PPO被描述为单个基因，其编码在王猪中具有单酚酶和二酚酶活性的蛋白质，与其他植物物种中仅PPO酶的二酚酶活性相比，PPO在核桃中的活性是一个独特的特征。
多年来，研究人员一直认为核桃PPO活性仅受单个JrPPO1基因的调节，使其成为研究酶促褐变的理想模型。
有趣的是，JrPPO1似乎在所有绿色组织中均有高水平的组成型表达，对损伤或茉莉酸甲酯治疗无反应。已有研究表明，核桃-细菌枯萎病相互作用诱导JrPPO1表达和PPO活性。
Zekiri等人使用一种新的纯化方法从王氏叶中纯化了两种JrPPO亚型，这些亚型的区别在于单个氨基酸，在王氏J.gia基因组序列的基础上发现了PPO的第二个同系物。
但其作用机制尚不清楚，Panis报道，与JrPPO2相比，JrPPO1对单酚表现出更大的活性，而JrPPO2对邻二酚的活性更高。
三、外植体褐变与JrPPO的关系
在组织培养过程中，通过优化培养基类型和改善培养条件可以降低褐变率，这两者都是组织培养研究的重点。
有人提出，液体介质和半固体介质等流体基介质可以有效减少外植体褐变，因为流动性好的介质中的有害物质会随着时间的推移而扩散。
然而，其他研究表明，增加琼脂浓度和降低流动性可以减少外植体褐变，这可能与所使用的特定材料有关。
在这项工作中，核桃外植体在两种不同类型的培养基中培养，即低渗透性琼脂和高渗透性蛭石。
测定外植体JrPPO表达和酚含量水平，阐明外植体褐变与JrPPO的关系，为核桃组织培养提供新的方法和理论。
四、外植体褐变与酚含量之间的联系
外植体褐变与组织培养中的酚含量密切相关。核桃外植体在使用插条和灭菌相关的环境条件下以及培养基中存在水和盐时会经历应激。
植物已经建立了一系列涉及细胞代谢、激素调节等的防御和保护体系，酚类含量增加以抵抗恶劣环境条件的影响。
但酚类化合物的高积累导致醌的产生增加，导致严重的褐变。本研究将核桃外植体培养在A或V培养基中，早期积累了大量的酚类化合物。
这可能是由于收集和灭菌过程中的损伤和应激造成的。培养基的渗透性和流动性对于减少外植体褐变非常重要。
A的通透性和流动性较低，后期外植体分泌的有害物质不能迅速分散，因此在外植体中积累;这些毒性作用导致严重的褐变。
V是一种颗粒状吸附性阳离子交换剂，具有良好的渗透性和流动性，外植体产生的有害物质可以在V中迅速传播，与褐变相关的死亡率很低。V中的初始培养可有效减少核桃外植体的褐变。
五、PPO对核桃外植体褐变的作用
植物可以通过主动和可逆的调节机制来适应逆境，褐变是由PPO和POD引起的现象，在机械损伤和非生物胁迫后的植物防御反应中，PPO和POD合成的水平增加。
PPO氧化酚类物质形成醌，并进一步聚合醌形成黑色素化合物。然而，在存在H2O2，POD还会氧化酚类物质并形成颜料。
H2O2正常植物组织中的浓度非常低，与PPO相比，POD对褐变的参与较少。本研究结果表明，在V中培养的外植体在72h时POD活性显著大于A。
在V中培养的外植体中的酚含量也明显低于A，2O2在早期阶段，特别是在A.PAL活性的内涝胁迫条件下促进酚类物质的合成并增加伤口诱导的毒性。
高水平的POD酶会迅速降低由H引起的PAL活性2O2机械损伤后松开。PAL活性的降低减缓了V培养的外植体中酚类物质的积累。
在A中培养的外植体中，POD活性在早期较低，这导致苯酚产量增加。在高活性PPO的催化下，酚类物质形成大量的醌，自聚合形成棕色颜料。
因在A中培养的外植体比在V.POD活性中培养的外植体更褐，并且在144h时，外植体中的酚含量更高。
V中PPO活性较低，导致外植体褐变最小，与POD相比，PPO可能是导致核桃外植体褐变的主要因素。
六、PPO与培养物中非生物胁迫的反应
质体定位的PPO与完整植物细胞中的酚类底物物理分离，主要分布在液泡中。细胞损伤破坏膜结构，PPO氧化酚形成醌。
魏和罗纳德的结果表明，弗吉尼亚松磨的褐变。抑制愈伤组织生长、芽分化和生根，与PPO的积累有关。
苏格兰松芽诱导愈伤组织PPO活性明显大于未褐变的未成熟胚胎，这表明成熟组织诱导的愈伤组织高PPO活性导致细胞死亡。
褐变组织中PPO活性的增加是对这些愈伤组织培养物中机械损伤和非生物胁迫的反应，本研究将外植体切割灭菌后，将其置于A或V培养基中，引起进一步的胁迫。
后续外植体中的酚类化合物含量和PPO活性均显著大于采集当天。值得注意的是，A培养基引起伤口附近酚类化合物的积累增加，加速了褐变反应，PPO的活性在后期持续增加。
A介质的渗透性和流动性较差，在初始阶段产生高水平的酚类化合物，JrPPO2的高表达导致JrPPO2活性增加，从而导致大量醌的产生。
植物组织中的新陈代谢被破坏，基因表达被下调或消除，这也是A培养基培养的外植体褐变相关死亡率高的原因。
在V培养的外植体中，早期酚类化合物的积累相对较低，JrPPO表达缓慢上调，因此这些外植体在此期间有效地修复了损伤。
虽然外植体中酚类化合物含量和后期JrPPO表达量增加，但此时外植体已逐渐适应外界环境，因此褐变死亡率较低。
七、PPO基因与组织和发育的关系
苹果中有两个PPO基因表现出独特的表达模式，并与组织和发育有关，APO5转录本仅在花卉发育后期检测到，而MD-PPO2转录本在花卉发育的所有阶段均被检测到。
在这项研究中，与APO2密切相关的JrPPO5在花器官中也高表达。此外，损伤导致APO5在叶片和果实中的表达显著增加，而MD-PPO2不受机械损伤的影响。
本实验将外植体置于切割灭菌后的培养基中，引起非生物胁迫，JrPPO2过表达，与苹果中APO5的表达模式一致。
在进化树的基础上，APO5和JrPPO2密切相关，这表明JrPPO2可能与抗逆性有关。此外，JrPPO1和JrPPO2的表达模式相反，JrPPO2表达的变化与PPO活性的变化相似。
由此推断，JrPPO2在酚类化合物的氧化中起关键作用。此外，APO5和JrPPO2表现出在其他物种中观察到的基序。
而MD-PPO2和JrPPO1都缺乏基序10。据推测，基序10可能在组织褐变过程中起作用，但其功能需要进一步研究。
八、结论
组织培养是幼苗快速育种和提高生产效率的有效方法，但外植体褐变是核桃组织培养的关键限制因素，导致核桃外植体褐变的PPO衍生醌的聚合尚不清楚。
本研究调查了在琼脂或蛭石培养基中培养的'赞美'核桃枝顶端的外植体，研究了外植体中存活率、POD和PPO活性以及JrPPO表达，以确定PPO在核桃外植体褐变中的作用。
V培养基大大降低了外植体的死亡率，V培养基和A培养基培养的外植体分别有89.9%和38.7%存活。
与0 h外植体相比，A培养的外植体PPO在整个培养过程中具有很高的活性，但在V中培养的PPO仍然较低。
A培养的外植体酚含量在72 h显著升高，但随后下降，V培养的外植体含量仅在144 h时升高。在V中培养的外植体中的POD显示出高活性，不会引起褐变。
基因表达测定表明，JrPPO1的表达在A和V培养的外植体中下调。JrPPO2在不同组织中的表达分析表明，JrPPO144在茎、嫩叶、成熟叶、猫、雌蕊和壳中高表达。
JrPPO1在成熟叶和雌蕊中高表达，此外，褐变测定表明，A和叶片组织中的外植体均表现出较高的JrPPO2活性。
酚类含量的迅速增加导致外植体褐变和死亡。V型培养基在短期内延缓了核桃外植体中酚类化合物的快速积累，显著降低了外植体死亡率。
JrPPO2在分支损伤后外植体酚类的氧化中起关键作用，酚类含量的快速增加导致外植体褐变和死亡，V介质在短期内延缓了核桃外植体中酚类化合物的快速积累。
使用V作为主要培养基有效减缓了核桃地冠顶端外植体的褐变，提高了存活率。JrPPO2在外植体褐变中起关键作用。